Nous présentons l’utilisation du protocole MeshAndCollect pour obtenir un jeu de données complet de diffraction, devant servir à la détermination de la structure ultérieure, composée de diffraction partielle des ensembles de données provenant de nombreux petits cristaux de la protéine fluorescente Cerulean.
Cristallographie aux rayons x est la technique majeure utilisée pour obtenir des informations de haute résolution concernant les structures 3D des macromolécules biologiques. Jusqu’à tout récemment, un impératif majeur a été la disponibilité de relativement grandes, bien diffractant cristaux, qui sont souvent difficiles à obtenir. Cependant, l’avènement de la cristallographie de série et une renaissance dans les méthodes de collecte de données multi-cristal a signifié que la disponibilité de gros cristaux ne doivent plus être un facteur limitant. Ici, Nous illustrons l’utilisation du protocole MeshAndCollect automatisé, qui identifie tout d’abord les positions de nombreux petits cristaux, monté sur le porte-échantillon même et puis dirige la collection des cristaux d’une série d’ensembles de données de diffraction partielle pour la fusion ultérieure et servir à la détermination de la structure. MeshAndCollect peut être appliqué à n’importe quel type de micro-cristaux, même si faiblement diffractant. À titre d’exemple, nous présentons ici l’utilisation de la technique pour résoudre la structure cristalline de la Cerulean protéine fluorescente Cyan (PCP).
Cristallographie de rayon x macromoléculaires (MX) est, de loin, la méthode la plus utilisée pour gagner la perspicacité de résolution atomique dans la structure tridimensionnelle de macromolécules biologiques. Toutefois, un grands goulets d’étranglement est la condition pour les cristaux assez grandes, bien diffractants.
Souvent, en particulier lorsque la cristallisation des protéines membranaires, seulement très petits cristaux de quelques microns dans la plus grande dimension peut être obtenu. Radiolésions effets limite la résolution d’une données de diffraction complets qui peut être collecté d’un monocristal micro2et très souvent, il est nécessaire d’améliorer le rapport signal sur bruit et donc données Réglez la résolution, par la fusion de plusieurs ensembles de données de diffraction partielle de cristaux différents, mais isomorphe. L’augmentation de densité de flux de faisceaux de rayons x à des sources de rayonnement synchrotron et ailleurs (p. ex. électron libre aux rayons x (X-FELs) des lasers), signifié que les ensembles de données de diffraction partielle utile peuvent être recueillis de même de très petits cristaux biologiques macromolécules. Cela, à son tour, a conduit au développement de nouvelles techniques pour la collecte et la fusion d’ensembles de données de diffraction partielle provenant de nombreux différents cristaux afin de produire un ensemble de données complet pour la solution de la structure. Ces techniques sont couramment dénommés série cristallographie (SX)3,4,5,6,7,8. Un exemple prototypique de SX est l’utilisation de dispositifs d’injecteur pour introduire un jet étroit d’une boue de cristal dans les rayons x faisceau3,4,5. Un schéma de diffraction est enregistré chaque fois qu’un cristal est exposé aux rayons x, menant à la collection de plusieurs milliers de cristaux individuels, de « still » images de diffraction, information qui est ensuite fusionnée pour produire un ensemble complet de données. Cependant, un inconvénient considérable de ce type de collecte de données en série est que le traitement d’images fixes peut être problématique. La qualité des données est considérablement améliorée si les cristaux peut être tournées ou plusieurs images de diffraction sont prélevés dans le même cristal en cristallographie série expériences6.
MeshAndCollect1 a été développé dans le but de combiner SX avec « standard » collecte de données de rotation MX et permet, de façon automatique, les expérimentateurs pour collecter des ensembles de données de diffraction partielle de nombreux cristaux de la même cible macromoléculaire monté sur les détenteurs des échantillons identiques ou différents. Un ensemble de données complet de diffraction est ensuite obtenu en fusionnant la plupart isomorphes des ensembles de données partielles recueillies. MeshAndCollect est compatible avec n’importe quel état-of-the-art synchrotron radiographie beamline pour MX (idéalement une installation de dispositif d’insertion avec un relativement petit (20 µm ou moins) faisceau de taille à la position de l’échantillon). Outre la compilation des ensembles de données complets d’une série de petits cristaux bien diffractants, la méthode est aussi très appropriée pour l’évaluation initiale expérimentale de la qualité de la diffraction de micro-cristaux et pour le traitement des échantillons opaques, par exemple, en Méso cultivé des microcristaux de membrane protéines9.
Au début d’une expérience de MeshAndCollect, les positions, en deux dimensions, de chacun des nombreux cristal contenu dans un porte-échantillon unique sont déterminées à l’aide d’une analyse aux rayons x de faible dose. Les images de diffraction, recueillies au cours de cette analyse sont analysées automatiquement par le programme DOZOR1, qui trie les positions des cristaux sur le porte-échantillon selon leur force respective de diffraction. Positions pour la collection d’ensembles de données partiels sont attribuées automatiquement en fonction sur un seuil de résistance de diffraction et, dans la dernière étape, petits coins des données de diffraction, typiquement ±5 ° de rotation, sont prélevés à chaque position choisie. L’expérience a montré que cette gamme de rotation fournit une quantité suffisante de réflexions par cristal pour l’ensemble de données partiel mise à l’échelle de fins, tandis que dans le même temps, réduire les problèmes de centrage cristal possible et la chance d’exposer les multiples cristaux dans un 1de soutien particulièrement encombré. Les cales de données de diffraction individuels (ensembles de données partiels) sont ensuite traitées soit manuellement ou à l’aide de traitement de données automatisé de canalisations10,11,12,13. Pour déterminer la structure en aval, il est alors nécessaire de trouver la meilleure combinaison d’ensembles de données partiels d’être fusionnée14,15,16 , après quoi le jeu de données complet qui en résulte peut être traité de la même manière comme un provenant d’une expérience de monocristal.
Comme un exemple de MeshAndCollect dans la pratique, nous vous présentons la solution de la structure cristalline de la protéine fluorescente Cyan (PCP) Cerulean, à l’aide d’un ensemble de données de diffraction construit à partir de la combinaison d’ensembles de données partiels recueillis à partir d’une série de microcristaux montés sur le même support de l’échantillon. Cerulean a été conçu de la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria17, dont chromophore fluorescent est autocatalytique formée par la cyclisation des trois résidus d’acides aminés consécutifs. Cerulean est obtenu à partir de GFP en mutation respectivement les résidus premiers et deuxième du chromophore, une sérine et une tyrosine, thréonine (S65T) et le tryptophane (Y66W) et en adaptant l’environnement chromophore avec davantage de mutations (Y145A, N146I, H148D, M153T et V163A) pour produire un niveau de fluorescence significative, mais sous-optimale de QY = 0.4918,19,20. Les propriétés fluorescentes sous-optimale de Cerulean ont été proposées pour être lié à la dynamique des protéines complexes impliquant la stabilisation de l’imparfait de l’un des onze brins-β de la protéine21 et à l’hébergement de deux différents chromophore isomères selon les conditions de pH et l’irradiation22. Nous avons choisi de travailler avec Cerulean comme protéine modèle illustrant l’utilisation du protocole MeshAndCollect raison de la relativement facilité de réglage de taille selon la cristallisation des cristaux. La structure de Cerulean est très similaire à ce que de sa protéine parent GFP, telle qu’elle est constituée d’un β-baril formé d’onze brins β entourant une hélice α, qui porte le chromophore.
Le succès d’une expérience de MX dépend habituellement de l’existence de relativement grandes, bien diffractant cristaux. Pour les projets où l’optimisation de douches petit cristal à cristaux plus grands échoue, MeshAndCollect fournit une possibilité d’obtenir un ensemble de données complet de diffraction pour structure solution via la combinaison isomorphes partielles des ensembles de données collectées d’une série de petits cristaux. La méthode est compatible avec des faisceaux de rayonnement synchrotron pour MX, idéalement avec un flux de photons de haute et d’un petit faisceau de diamètre, équipé d’un dispositif de diffractomètre de pointe et d’un détecteur de lecture rapide. Une telle station de fin, la partie de collection de données d’une telle expérience prendra environ 20 minutes, selon le nombre d’ensembles de données partiels à prélever et le nombre de détenteurs d’échantillon cristallifères à analyser.
La plus importante condition pour le succès d’une expérience de MeshAndCollect est l’existence d’un nombre suffisant (au moins 50, 100 idéalement) des grilles des positions sur le porte-échantillon. De l’expérience, la taille minimale des cristaux à analyser doit être environ 5 µm de la plus petite dimension. La méthode est compatible avec n’importe quel standard compatible cryo-refroidissement détenteurs de l’échantillon avec les meilleurs résultats atteints à l’aide de treillis montures qui sont rigides et droites.
À l’ESRF, MeshAndCollect est implémenté de manière conviviale dans un flux de travail à la Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 disponible à partir du logiciel de contrôle de source de rayonnement MXCuBE2. Un avantage majeur de MeshAndCollect par rapport aux autres méthodes SX que les données recueillies peuvent être traitées par des programmes standards et automatisée des pipelines utilisés pour MX monocristal.
Comme le montre notre exemple, MeshAndCollect est très facile à appliquer et conduit à une série d’ensembles de données de diffraction partielle, provenant généralement de petits cristaux, qui peut être fusionnés pour produire un ensemble complet de données devant servir à la solution de la structure. Par ailleurs, MeshAndCollect a le potentiel d’ouvrir l’espace de l’échantillonnage de cristallographie des protéines car il fournit un moyen de recueillir des données utiles provenant d’essais de cristallisation où la dernière étape de l’optimisation, la production de gros cristaux, est infructueuse.
À la lumière de l’évolution actuelle vers les sources de rayons x plus lumineux (p. ex., Source extrêmement brillante (EBS) projet/ESRF35), il est prévisible que, en raison des dommages de rayonnement accru, le type de collecte de données multi-cristal facilitée par MeshAndCollect deviendra la méthode standard de collecte de données, plutôt qu’une exception – comme c’est actuellement le cas – à faisceaux de MX axés sur le rayonnement synchrotron.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions l’ESRF pour fournir des temps de faisceau par le biais de son programme de recherche interne.
Beamline | ESRF ID 23-1 | ||
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Crystallization plates XDXm with sealant | Hampton Research | HR3-306 | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
Escherichia coli BL21 (DE3) | Life Technologies Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
HEPES | Euromedex | 10-110-C | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13452-1KG | |
MicroMeshes 700/25 | MiTeGen | SKU: M3-L18SP-25L | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | P5413-500G | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
Superdex 75 10/300 -GL | GE healthcare | 17-5174-01 | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
Unipuck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Programs | |||
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
aimless | MRC Laboratory of Molecular Biology | Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013). | |
ccCluster | ESRF | Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). | local development |
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
MeshAndCollect workflow | ESRF | Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). | local development |
MXCuBE2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). | local development |
XDS | Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung | Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010) |