JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü

Published: March 19, 2019
doi:
10.3791/58594
, , , , , , , ,
1European Synchrotron Radiation Facility,Structural Biology Group, 2European Molecular Biology Laboratory, 3Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS (Institut de Biologie Structurale)

Summary

Biz kullanılmak üzere sonraki yapı belirlenmesi, kısmi kırınım veri kümeleri floresan protein Cerulean birçok küçük kristaller toplanan oluşan bir tam kırınım veri kümesi elde etmek için MeshAndCollect Protokolü’nün kullanılmasına mevcut.

Abstract

X-ışını kristalografisi biyolojik oluştururlar 3 boyutlu yapıları ile ilgili yüksek çözünürlüklü bilgi elde etmek için kullanılan önemli bir tekniktir. Yakın zamana kadar önemli bir ihtiyacı de sık sık elde etmek için zor olan kristalleri diffracting kullanılabilirliğini nispeten büyük olmuştur. Ancak, seri kristalografisi gelişiyle ve bir Rönesans çok kristal veri toplama yöntemleri demekti kullanılabilirliğini büyük kristaller artık kısıtlayıcı bir faktör olması. Burada, ilk üzerinde aynı örnek sahibi monte birçok küçük kristaller konumlarını tanımlayan ve sonra kristalleri koleksiyonundan kısmi kırınım veri kümeleri için bir dizi yönlendirir otomatik MeshAndCollect Protokolü kullanımını göstermektedir Sonraki birleştirme ve kullanım yapısı belirlenmesi. MeshAndCollect bile zayıf diffracting mikro-kristaller, herhangi bir türü için uygulanabilir. Örnek olarak, burada mavi flüoresan Protein (CFP) Cerulean kristal yapısını çözmeye tekniğin kullanımı mevcut.

Introduction

Makromoleküllerin x-ışını kristalografisi (MX), uzak, biyolojik oluştururlar üç boyutlu yapılar atomik çözünürlük içgörü kazanma için en çok kullanılan yöntemdir. Ancak, bir büyük şişe boyunlu gereksinim görece büyük, iyi diffracting kristalleri var.

Sık sık ve özellikle membran proteinlerinin crystallizing zaman, en büyük boyut birkaç mikron sadece çok küçük kristalleri elde edilebilir. Radyasyon hasarı, etkileri sınırı bu tam kırınım veri çözünürlüğe ayarlanmış bir tek mikro kristal2ve çok sık toplanabilir sinyal gürültü oranı artırmak gereklidir ve bu nedenle koymak veri çözünürlük, birkaç birleştirerek Kısmi kırınım veri kümelerinden farklı ama izomorfik kristalleri. Röntgen ışını sinkrotron kaynakları ve başka bir yerde (örneğin x-ışını serbest elektron lazerler (X-FELs)), akı yoğunluğu artışlar yararlı kısmi kırınım veri kümeleri biyolojik bile çok küçük kristalleri toplanabilir anlamı oluştururlar. Bu, sırayla, koleksiyon için yeni teknikler gelişmesine neden olmuştur ve kısmi kırınım veri kümelerinin birleştirme yapı çözüm için tam bir veri kümesi üretmek için birçok farklı kristalleri toplanan. Bu tür teknikler yaygın olarak seri kristalografisi (SX)3,4,5,6,7,8olarak adlandırılır. Bir prototip SX kristal Bulamaç dar bir dere röntgen ışını3,4,5tanıtmak için enjektör cihazların kullanımı örnektir. Kırınım deseni her bir kristal koleksiyon, ‘sabit’ kırınım görüntü, o zaman tam bir veri kümesi oluşturmak için birleştirilmiş bilgileri tek tek kristalleri binlerce lider röntgen maruz kaydedilir. Ancak, bu tür bir seri veri toplama önemli bir dezavantaj hala görüntü işleme sorunlu olabilir olduğunu. Veri kalitesi önemli ölçüde, kristaller döndürülebilir ve/veya birkaç kırınım görüntü aynı kristal seri kristalografisi deneyler6sırasında toplanan artırıldı.

MeshAndCollect1 SX ‘standart’ MX döndürme veri toplama ile birleştirerek amacı ile geliştirilmiş ve sağlar, otomatik bir biçimde Denemecileri kısmi kırınım veri kümeleri aynı makromoleküllerin hedefinin çok sayıda kristalleri toplamak için aynı veya farklı örnek sahipleri monte. Tam kırınım veri kümesi sonra toplanan kısmi veri kümesinin en isomorphous birleştirerek elde edilir. MeshAndCollect, herhangi bir devlet-of–art sinkrotron x-ışını beamline için MX ile uyumludur (ideal olarak bir ekleme aygıt özelliği sayesinde nispeten küçük (20 µm veya daha az) ışınla boyutu örnek konumda). Tam veri kümeleri bir dizi küçük, iyi diffracting kristalleri derleme ek olarak, aynı zamanda çok mikro-kristal kırınım kalitesini ilk deneysel değerlendirilmesi için ve opak örnekleri işlenmesi için uygun yöntemdir, Örneğin, meso microcrystals membran proteinleri9büyüdü.

MeshAndCollect deney başlangıcında, düşük doz x-ışını tarama kullanarak iki boyutlu olarak her bir tek örnek tutucu içinde yer alan birçok kristal konumlar belirlenir. Bu tarama sırasında toplanan kırınım görüntüleri otomatik olarak program DOZOR1, pozisyonları örnek kutusunda ilgili kırınım güçlerini göre kristallerinin sıralar tarafından incelenir. Pozisyonlar kısmi veri kümeleri topluluğu için bir kırınım güç kesme göre otomatik olarak atanır ve son adımda seçtiğiniz her pozisyondan kırınım veri, genellikle ±5 ° dönme, küçük takozlar toplanır. Deneyim bu rotasyon Aralık yansımaları kristal kısmi veri kümesi aynı zamanda, mümkün kristal merkezleme sorunları ve birden çok kristaller açığa olasılığını azaltmak amacıyla ölçekleme için ücret yeterli miktarda sağlar göstermiştir bir özellikle kalabalık destek1. O zaman bireysel kırınım veri dilimleri (kısmi veri kümeleri) vardır ya el işleme veya otomatik bilgi işlem kullanarak boru hattları10,11,12,13. Aşağı akım yapı belirlenmesi için sonra kısmi veri kümeleri birleştirilen14,15,sonra elde edilen tam veri kümesi aynı şekilde tedavi edilebilir16 yaşında olmak en iyi kombinasyonu bulmak gereklidir bir tek kristal deneyden gönderilmiş gibi.

Pratikte MeshAndCollect örneği, biz burada mavi flüoresan Protein (CFP) Cerulean kristal yapısını çözüm kısmi veri kümeleri bir dizi toplanan kombinasyonu inşa bir kırınım veri kümesi kullanarak mevcut microcrystals üzerinde aynı örnek destek monte. Cerulean gelen yeşil flüoresan Protein (GFP) üzerinden denizanası Aequorea victoria17olan flüoresan chromophore autocatalytically üç ardışık amino asit kalıntıları cyclisation oluşturulur, mühendislik. Cerulean GFP sırasıyla birinci ve ikinci artıkları chromophore, bir serin ve treonin (S65T) ve triptofan (Y66W) bir tirozin mutasyona ve daha fazla mutasyonlar (Y145A, N146I, H148D, M153T chromophore ortamla uyum elde edilir ve V163A) QY önemli henüz suboptimal Floresans düzeyi üretmek için = 0,4918,19,20. Cerulean suboptimal floresan özelliklerini bir protein21 on β iplikçiklerinin kusurlu sabitleme içeren karmaşık protein dynamics ve iki farklı chromophore konaklama bağlanması için önerilen İzomerler bağlı olarak pH ve ışınlama koşulları22. Nedeniyle MeshAndCollect Protokolü’nün kullanılmasına gösteren bir model protein olarak Cerulean ile çalışmak seçtik nispeten kristal boyutuna bağlı olarak kristalizasyon ayarlama kolaylığı. Cerulean onun üst protein GFP, β-varil, oluşturdu gibi on β-bir α-chromophore taşıyan helix, çevreleyen ipliklerini kurdu çok benzer bir yapıdır.

Protocol

1. ifade ve Cerulean arıtma Not: Bu Lelimousin vd tarafından Yayınlanan Protokolü dayanmaktadır 21 O’nun öğesini Cerulean Escherichia coli BL21 hücreleri otomatik indüklenebilir orta23 4 L olarak 37 ° C’de OD600kadar yetiştirilen içinde hızlı = 1 ve gecede 27 ° C’de kuluçkaya 5000 x g de bakteri hücreleri hasat ve sonication hücreleri yoluyla koşullar (% 40, 5 dk, 10 s darbe, 10 s Duraklat) 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl ve 1 proteaz inhibitörleri EDTA ücretsiz x oluşan arabellek 200 ml. Bir tuzak onun Ni-NTA sütunda süpernatant yük ve Cerulean ile 100 mM imidazole aynı arabellek koşullarında elute. Parlak sarı renkli kesirler havuz. Protein özünde renklidir, dolayısıyla Cerulean içeren kesirleri kolaylıkla ayırdedilebilir. Protein (4 mL) 20 mM Tris pH 8.0 S75 sütununda arındırmak. Parlak sarı kesirler havuz ve protein çözüm 15 mg/ml konsantre. 2. kristalizasyon Asılı damla kullanın Buhar Difüzyon tekniği24 20 ° c de Linbro plakaları. Kuyu 1 mL 100 mM HEPES pH 6,75, % 12 ‘ PEG8000 ve 100 mM MgCl oluşan bir precipitant çözeltisi ile doldurmak2. Asılı damla için 15 mg/ml precipitant çözüm 1 µL ile mix 1 µL protein konsantre. Kristalleri 24 h içinde görünmelidir. Kristalleri elde hasat ve transfer onlara sağlanan bir arabellek 100 µL 0.1 M HEPES pH 6,75 oluşur, % 22 8000 PEG. Kristalleri 0.1 mL doku öğütücü ile eziyet ve arabellek (oranı 1: 100) tohum oranında seyreltin. Bir aliquot tripsin (aynı arabellek 0,5 mg/mL) ile protein hisse senedi çözüm (15 mg/mL) 1 h (1:10 (v/v)) sindirmek. Yüzde 10’u ile tohum içeren sindirilir protein çözüm mix arabellek (v/v). Kristalleri büyümek (10 * 10 * 20 µm3) 0.1 M HEPES pH 7, % 14 8000, PEG MgCl2 1-1.5 μL asılı’damla buharı difüzyon yöntemi kullanarak 0.1. 3. kristal montaj Uygun bir döngü, bir kafes döngü 700 kare delik 25 µm bir omurga standart örnek sahibi25tarihinde Monte Örneğin, kullanın. Kristaller (Adım 2.6) kristalizasyon damla–dan cryoprotectant çözüm (de precipitant çözüm gliserol (% 20 v/v son) ile karışık) 1 µL içine aktarın. Döngü’nün altında kristalleri taşıyarak ve onları damla dışarı kaldırma protein kristal Bulamaç bir kafes döngü üzerine monte. İdeal olarak kristalleri 5 mikron-maksimum boyut 30 µm arasında döngü içinde monte kristalleri hiçbir çakışma ile boyut aralığı içinde olmalıdır. Aşırı sıvı hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile monte dokunarak fitil. Tortu kristalleri böylece mümkün olduğu kadar az toplu sıvı çevrili döngü, bir düzlemde oturuyorlar. Mount unipuck sıvı nitrojen dolu Dalma. Işın zaman kullanılabilir duruma gelene kadar 100 k Pak uygun saklama kabı içinde saklayın. 4. çevrimdışı sinkrotron deneme hazırlanması Not: istek sinkrotron ışın süresi gibi erken mümkün olduğunca ve kullanılabilir erişim türleri için ve nasıl belirli bir sinkrotron için bir başvuru çevrimiçi yönergeleri izleyin. ESRF yönergeleri http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying bulunabilir. Bir üye bir ESRF blok ayırma grup (çanta) Eğer, bir uygulama belirli her proje için gerekli değildir. Bu durumda Denemecileri ışın süresi planlamasını ile ilgili onların çanta sorumlu erişmeniz gerekir. Teklif kabul ve deneme için bir davet aldı sonra tüm katılımcıların güvenlik eğitimi tamamlamak gerekir. “A-biçimli” (via ESRF kullanıcı portalı, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) örnekleri güvenlik bilgileriyle doldurun. Deneme görüşmek üzere yerel iletişim kişiye başvurun. A-biçimli gönderilmiş ve doğrulanmış bir kez size deneme numarası ve şifre verecektir. Genişletilmiş ISPyB-26 (http://www.esrf.fr/) bağlanmak ve MXseçin. Deney numarası ve parola–dan A-biçimli oturum. Gönderiyi seçin | Yeni ekle ve istenen bilgileri doldurun. Parsel Ekle seçin ve ilgili bilgileri doldurunuz. Ekleme kapsayıcıseçin, bir unipuck seçin ve Pak örnek sahipleri konumlarını dahil olmak üzere gerekli bilgileri doldurun. 5. yükleme örneği üzerine bir Beamline Deneysel hutch, Pak örnek değiştirici (SC) yük dewar ve konumunu not alın. Deneysel kabin kilitleme ve denetim hutch girin. ISPyB (https://esrf.fr/) giriş yapın. Deneme hazırlamakseçin, sevk irsaliyesi bulmak, İleri ‘ yi seçin ve beamline ve SC puck konumda göstermek Beamline kontrol yazılımı, burada MXCuBE227,28 A-biçimli sağlanan parola ve deneysel numarası ile giriş yapın. Basın beamline kontrol yazılımı ISPyB veritabanıyla eşitlemek için eşitleme . Beamline kontrol yazılımı, gonyometre üzerine örnek sahibi bağlamak için kullanın. MXCuBE2 içinde doğru tıkırtı örnek değiştirici alan bir konumda ve Mount örnekseçin. Yüklü MK3 Mini kappa gonyometre29 yararlanarak en ESRF MX beamlines MXCuBE2’ın “görsel yeniden düzenlenmesi” iş akışı30 örnek sahibi uçakla gonyometre dönme ekseninin hizalamak için kullanın. Sonra 3-click Merkezi döngü ucu kenarına ortasında Merkezi düğmesini seçin. Ortalanmış konumu Kaydetseçerek Kaydet. Daha sonra 3-click Merkezi kök döngünün başlangıç orta Merkezi butonuna tıklayın. İkinci pozisyon de Kaydettıklayarak kaydedin. Kaydedilmiş ortalanmış konumlarından tıklayarak seçin. Gelişmişaltında iş akışı görsel hale gelmesini MxCuBE2 veri toplama Kuyruğa Ekle. İş akışı üzerinde toplamak sıratıklatarak başlatın. Sonra iş akışı örnek sahibi uçak gonyometre, Merkezi örnek sahibi tekrar, bu sefer mesh ortasında bir yere dönme ekseninin ile hizalar. Örnek sahibi mesh çehresini MXCuBE2 kullanarak omega eksen döndürerek röntgen ışını yönüne dik gelecek şekilde yönlendirin. MXCuBE2 içinde (beamlines değişken ışın boyutu ile için) örnek sahibi taramak için gerekli ışın boyutu seçin. Diyafram damla aşağı yemek listesi içinde beamline kontrol yazılımı tıklatın ve bir değer, Örneğin, 10 µm seçin. Bir kafes kafes inceden inceye gözden geçirmek için tanımlayın. MXCuBE2 kafes aracı simgesini tıklatın. Kafes aracı pencere-ecek gözükmek. MXCuBE2 örnek görünümünde mesh yaptı tıklayarak ve kristalleri örnek kutusunda içeren alanı üzerinde fareyi sürükleyerek çizin. Mesh kaydetmek için tıklatın kafes aracı penceresinde artı düğmesini (mesh olur yeşil). 6. hazırlamak ve MeshAndCollect iş akışı yürütmek Hangi kırınım görüntüleri toplanmalıdır, çözünürlük (ddk) Örneğin, burada 1.8 Å MXCuBE2 Çözünürlük alanına girin. MeshAndCollect Gelişmiş veri koleksiyon sekmesini seçin, sıraya eklemek ve toplamak sıra’ ı tıklatın. Görünen parametre penceresinde, beamline bağımlı varsayılan parametrelerini kullanın. Denemede burada varsayılan parametreleridir 0,037 s çekim hızı kafes tarama noktası, (Bu durumda 4 x 1011 ph/s için lider) % 100 iletim, 1 ° salınım kafes tarama satır başına nitelendirdi. Continue’ ı tıklatın. Ağ Tarama çalışır ve her kılavuz noktada toplanan kırınım görüntüleri analiz ve kırınım gücü DOZOR1yazılımıyla göre sıralanır. Bu işlem arka planda çalışır. DOZOR analiz sonra bir ısı haritası oluşturulur ve sonraki kısmi veri koleksiyon için sipariş kırınım gücü göre otomatik olarak atanır (bkz. şekil 1).Not: Bu adımı sonuçlarını da ISPyB içinde kontrol. Beamline kontrol yazılımı ayarları ile yeni bir sekme açılır kısmi veri kümelerinin koleksiyonu için döndürme aralığı (Yani, 0.1 °), sayı-in imge (Örneğin, 100), pozlama süresi, çözünürlük, iletim için uygun değerleri seçin, Ters ışın vb tahsil edilecek her kama için doz (30 MGy) Garman sınırın altına en ideali. 0.037 yaklaşık pozlama zamanı resim başına 0,1 için s s açıklanan deneysel koşullarda. Kısmi Veri toplamalarını başlatmak için devam ‘ ı tıklatın. 7. veri işleme Not: Kısmi veri kümeleri uygun bir program (XDS10) ile entegre edilmiştir. Bir Python komut her bireysel veri kümesi tanıyan, o bütünleşmek ve farklı kısmi veri kümesi arasındaki dizin oluşturma tutarlı olduğundan emin olur bunun için kullanılacaktır. Görüntüleri içeren klasörü açın: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean. Emanet nerede kısmi veri kümeleri toplanır klasöründe bulunan işlem alt klasörü kopyalayın. Linux terminal komutu cp-r işlemi process_backupkullanın. İşlem klasöre gidin ve işleme komut dosyasını çalıştırın. Linux terminal komutu cd süreci yazın ve vurmak girmek. Türü procMultiCrystalData ve vurmak girmek.Not: Komut bir alan grubu için soracaktır ve hücre parametreleri, (Bu bilgi isteğe bağlı) bu talimatlara göre girin. Bir son kullanıcı onay alındıktan sonra komut dosyası otomatik olarak çalışır. 8. birleştirme veri kümelerinin Not: sonra tüm kısmi veri kümeleri entegre onları en iyi kombinasyonu birleştirilir yapı belirlenmesi ve arıtma için son veri kümesi üretmek için. Farklı amaçları bu birleştirme işleminin tam bütünlüğü (yüksek oranda önerilir), yüksek çeşitlilik veya en iyi veri istatistikler elde etmek için olabilir (yüksek , düşük R-faktörler, vb). Bu seçeneği dikkatli seçilmelidir ikinci bazen bütünlüğü ve/veya çokluğu pahasına olabilir. Program ccCluster14kullanarak kısmi veri kümesi birleştirmek. İsomorphous kısmi veri kümeleri () olası birleşimlerini belirlemek için hiyerarşik küme Analysis (HCA) kullanır. CcCluster onun graphical kullanıcı arayüzey (GUI) açmak için UNIX terminalinin yazın.Not: bir dendrogram ccCluster GUI çizilir. Bu isomorphism aralarında dayalı kısmi veri kümeleri en iyi hangi birleştirilebilir bir öneri verir. Dikey eksende 0.4 konuda değerine karşılık gelen bir düğümü tıklatın. Genel olarak, daha yüksek değerler daha kısmi veri kümeleri ama kısmi veri kümelerini daha az isomorphous olarak istatistikleri birleştirme daha kötüye doğru yol içerir. Veri birleştirme’ yi tıklatın. Seçili küme arka planda işlenir ve tahmini birleştirme istatistikleri GUI yeni bir sekmede görüntülenir. Bu adımı veri kümeleri farklı kombinasyonları için tekrar edilebilir. Kısmi veri kümeleri iyi bir kombinasyon için tam % 100 yakın değerler yüksek olmalıdır (10 veya daha yüksek içinde en düşük çözünürlük deniz hayvanı kabuğu) ve (% 5 içinde alçak kararlılık deniz hayvanı kabuğu) R-Guinan31 değerleri düşük. Seçili her birleşim için oluşturulan giriş komut dosyası bir tek mtz dosyaya (Yani, anlamsız32) seçilen kısmi veri kümelerini birleştirmek için kullanın. Kesin olarak ölçeklemek ve ölçekleme programı (Yani, amaçsız32) kullanarak bu dosyadaki yoğunluğu veri birleştirme ve, olarak bir tek kristal veri derlemeden kaynaklanan bir dosya çıktı sonraki phasing ve yapı çözüm33 için kullanım .

Representative Results

MXCuBE2 içinde uygulanan MeshAndCollect (bakınız şekil 1A), kısmi kırınım veri kümelerinden kristalleri görsel tanımlaması zor aynı örnek tutucu üzerinde yer alan Cerulean küçük kristalleri toplanması için kullanıldı. Meshloop merkezi bir kılavuz çektik örnek sahibi ekran için (bkz. şekil 1B) ve üzerinde DOZOR göre puan ısı harita veri kümeleri otomatik olarak toplanan (bakınız şekil 1 c, 1 D) 85 kısmi kırınım. Bunlar tek tek entegre edildi sonra (yukarı bakın) ddk % 99.8 bütünlüğü ile bir veri kümesi oluşturmak için birleştirilmiş 1.7Å = (bkz. Tablo 1). Yarı-set korelasyon (CC1/2)34 en yüksek çözünürlük kabuğu’nda (4.7 =) % 60 olduğunu. Beklendiği gibi Cerulean kristal yapısını delikanlı oluşturulan veri kümesi kullanarak moleküler yerine33 tarafından çözülmüş olabilir. Arıtma sonra bir Riş ,8 ve bir Rücretsiz ,4 elde. Daha önce kararlı yapısı (PDB giriş 2WSO21) ile süperpozisyon gösterir bir küresel rmsd 0.1 Cα pozisyonlar Å. Birleştirilmiş veri kümesinin istatistikleri Eşik kümeleme 0,35 Kısmi veri kümeleri sayısı 25 Alan grubu P212121 Birim hücre (a, b, c) 50.98, 62.76, 69.50 Çözünürlük aralığı 46.58-1.70 (1.73-1.70) Rmerge (tüm ben + ve -) 0,133 (0.743) Rmeas (tüm ben + & ben-) 0.142 (0.813) Rpim (tüm ben + & ben-) 0.047 (0.318) Gözlemler toplam benzersiz 220693/25129 Mean((I)/SD(I)) 13,8 (4,7) MN(I) yarı-set korelasyon CC(1/2) 0.994 (0.602) Bütünlüğü 99.8 (99.5) Çeşitlilik 8,8 (6,5) Son Rcryst 22,8 Son Rücretsiz 25,4 Tablo 1: İstatistik verilerin yüksek kalitesini gösteren birleştirilmiş veri kümesinin toplanan. Resim 1: bir dizi küçük kristaller aynı örnek tutucu içinde bulunan kısmi veri kümeleri bir dizi toplamak için MeshAndCollect kullanarak. A) kullanıcı arabirimi, MXCuBE2. Eksen üzerinde görüş alanın üzerinde yeşil oval ızgara aracı gösterir. B) ile görüntü hayat görüntü alanında örnek sahibinin üzerine bir tablo çizilir. DOZOR puanları C) ısı haritası. D) bir kırınım görüntü örneği. E) hiyerarşik küme analizi sonra Dendrogram. Kırmızı veri kümeleri birleştirme için kullanılmıştır. F) Cerulean genel yapısını. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

MX deney başarısı genellikle de kristaller diffracting varlığını nispeten büyük üzerinde bağlıdır. Nerede büyük kristalleri için en iyi duruma getirme küçük kristal duş üzerinden başarısız projeler için MeshAndCollect tam kırınım veri kümesi için yapı çözüm yolu ile isomorphous kısmi veri kümeleri toplanan kombinasyonu elde imkanı sağlar. küçük kristaller serisinden. Yöntem sinkrotron beamlines MX için ideal bir konuma sahip bir yüksek foton akı ve en modern diffractometer cihaz ve bir hızlı okuma dedektörü ile donatılmış bir küçük ışın çapı ile uyumludur. Böyle bir uç istasyon üzerinde böyle bir deneme veri koleksiyon parçası tahsil edilecek kısmi veri kümelerinin sayısını ve çözümlenecek kristal içeren örnek sahipleri sayısı bağlı olarak yaklaşık 20 dakika sürer.

Yeterli sayıda varlığını MeshAndCollect deney başarısı için en önemli koşuldur (en az 50, 100 ideal) örnek sahibi pozisyonlar diffracting in. Deneyim, çözümlenmesi için kristalleri en az boyutu en küçük boyut yaklaşık 5 mikron olmalıdır. Yöntemi her türlü standart uyumlu cryo-soğutma ile uyumludur örnek sahipleri en iyi sonuçları ile sert ve düz bağlar kafes kullanarak elde edilmektedir.

ESRF MeshAndCollect bir Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) iş akışı30 MXCuBE2 beamline kontrol yazılımı kullanılabilir kullanıcı dostu bir şekilde uygulanmaktadır. MeshAndCollect diğer SX yöntemlerine göre önemli bir avantajı toplanan veriler standart programların işlenebilir ve tek kristal MX için kullanılan boru hatları otomatik.

Bizim örnekte gösterildiği gibi MeshAndCollect uygulamak çok kolay ve kısmi kırınım veri kümeleri, genellikle yapısı çözümde kullanmak için tam bir veri kümesi oluşturmak için birleştirilmiş küçük kristaller toplanan bir dizi yol açar. Ayrıca, MeshAndCollect son optimizasyon adım büyük kristaller, üretimini başarısız nerede kristalizasyon denemeler kullanılabilir veri toplamak için bir yol sağlar gibi protein kristalografisi örnekleme yer açmak potansiyeline sahiptir.

Artan radyasyon hasarı nedeniyle çok kristal veri toplama türünü kolaylaştırdı öngörülebilir parlak x-ışını kaynakları (Örneğin, son derece parlak kaynak (EBS) proje/ESRF35) doğru güncel gelişmeler ışığında Şu anda – synchrotron tabanlı MX beamlines, olduğu gibi MeshAndCollect tarafından standart yöntemi bir özel durum – yerine veri toplama olacak.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ESRF ışın zaman onun şirket içi araştırması programı aracılığıyla sağlamak için teşekkür ederiz.

Materials

Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. . Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 – 2022). The orange book. , (2015).

Tags

MeshAndCollectSerial CrystallographyRotation Data CollectionSmall CrystalsPuck SamplesStructure SolutionLigand ScreeningSynchrotron BeamlineVMXProtein Crystallography BeamlineSample ChangerData CollectionVisual Reorientation Workflow

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image