بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت
Summary
ونقدم استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت للحصول على مجموعة بيانات حيود كاملة، لاستخدامها في تصميم هيكل اللاحقة، تتألف من مجموعات البيانات حيود الجزئية التي تم جمعها من العديد من بلورات صغيرة من البروتين نيون أزرق.
Abstract
علم البلورات بالأشعة السينية هو التقنية الرئيسية المستخدمة للحصول على معلومات عالية الدقة بشأن هياكل ثلاثية الأبعاد للجزيئات البيولوجية. وحتى وقت قريب، كان شرط رئيسي توافر كبيرة نسبيا، كذلك ديفراكتينج البلورات، التي غالباً ما تكون صعبة للحصول على. ومع ذلك، يعني ظهور المسلسل علم البلورات ونهضة في أساليب جمع البيانات متعددة كريستال أن التوافر بلورات كبيرة لم تعد بحاجة إلى أن عاملاً يحد. هنا، نحن لتوضيح استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت الآلي، الذي يحدد مواقف العديد من بلورات صغيرة محمولة على حامل العينة نفسها أولاً وثم توجه جمع من البلورات سلسلة من مجموعات البيانات حيود الجزئي دمج اللاحقة واستخدامها في تصميم الهيكل. ميشاندكوليكت يمكن تطبيقها على أي نوع من مايكرو-بلورات، حتى لو كان ضعيفا ديفراكتينج. على سبيل مثال، نحن الحاضرين هنا باستخدام تقنية لحل هيكل كريستال أزرق سماوي الفلورسنت البروتين (CFP).
Introduction
الجزيئات في علم البلورات بالأشعة السينية (MX) هو، إلى حد بعيد، الأسلوب الأكثر استخداماً لاكتساب نظرة ثاقبة القرار الذري هياكل ثلاثية الأبعاد للجزيئات البيولوجية. ومع ذلك، أعناق زجاجة رئيسي هو الشرط لبلورات كبيرة نسبيا، وكذلك ديفراكتينج.
كثير من الأحيان، ولا سيما عند بلورة البروتينات الغشاء، يمكن الحصول على بلورات صغيرة جداً فقط من بضعة ميكرونات في البعد أكبر. أضرار الإشعاع الحد آثار تعيين الدقة البيانات حيود كاملة التي يمكن جمعها من كريستال الصغير واحد2، وفي كثير من الأحيان، فإنه من الضروري تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء، ومن ثم تعيين بيانات القرار، عن طريق دمج عدة مجموعات البيانات حيود جزئية من بلورات مختلفة، ولكن إيسومورفيك. الزيادات في كثافة التدفق للأشعة السينية الشعاع السنكروتروني مصادر وأماكن أخرى (مثل الأشعة السينية مجاناً-إلكترون ليزر (إكس-فيلس))، وقد يعني أنه يمكن جمع مجموعات البيانات حيود جزئية مفيدة من بلورات صغيرة جداً حتى البيولوجية الجزيئات الكبيرة. هذا، بدوره، أدى إلى تطوير تقنيات جديدة لجمع ودمج مجموعات البيانات حيود الجزئية التي تم جمعها من بلورات مختلفة كثيرة من أجل إنتاج مجموعة بيانات كاملة لهيكل الحل. هذه التقنيات يشار عادة إلى البلورات المسلسل (SX)3،4،5،6،،من78. مثال تنميط SX هو استخدام الأجهزة حاقن ﻹدخال تيار ضيقة من الملاط كريستال الأشعة السينية شعاع3،،من45. يتم تسجيل نمط حيود كل مرة يتعرض بلورة للأشعة السينية مما يؤدي إلى جمع ومن عدة آلاف من بلورات منفردة، من ‘لا يزال’ حيود الصور والمعلومات التي يتم دمجها ثم إنتاج مجموعة كاملة من البيانات. عيب كبير هذا النوع من جمع البيانات التسلسلية غير أن معالجة الصور الثابتة يمكن أن يمثل مشكلة. هو إلى حد كبير تحسين نوعية البيانات إذا بلورات يمكن تدويرها و/أو جمعت العديد من الصور الحيود من الكريستال نفس خلال تجارب البلوري المسلسل6.
ميشاندكوليكت1 وضعت بهدف الجمع بين SX ‘قياسي’ MX التناوب جمع البيانات، ويسمح، بطريقة تلقائية، المجربون تجميع مجموعات البيانات حيود جزئية من بلورات العديد من الجزيئات نفس الهدف شنت على المكلفين بعينه نفس أو مختلفة. ثم يتم الحصول على مجموعة بيانات كاملة حيود عن طريق دمج إيسومورفوس معظم مجموعات البيانات الجزئية التي تم جمعها. ميشاندكوليكت ومتوافق مع أي بيمليني الأشعة السينية السنكروتروني الدولة للفنون للإرسال المتعدد (مثالي إدراج جهاز منشأة صغيرة نسبيا (20 ميكرون أو أقل) شعاع الحجم في الموضع عينة). بالإضافة إلى تجميع مجموعات البيانات كاملة من سلسلة من بلورات صغيرة، ديفراكتينج جيدا، يكون الأسلوب أيضا مناسبة جداً لتقييم نوعية حيود الصغرى-بلورات التجريبية الأولية وتجهيز العينات معتمة، على سبيل المثال، في المتوسط نمت ميكروكريستالس من غشاء بروتينات9.
في بداية تجربة ميشاندكوليكت، تتحدد المواقف، في بعدين، كل من الكريستال كثيرة الواردة في عينة واحدة حامل باستخدام فحص بالأشعة سينية جرعة منخفضة. يتم تحليل حيود الصور التي تم جمعها خلال هذا المسح تلقائياً من البرنامج1من الإشراف، الذي يفرز مواقف البلورات على صاحب العينة طبقاً لقوتها حيود كل منهما. مواقع لتجميع مجموعات البيانات الجزئية يتم تعيينها تلقائياً استناداً إلى وقف إنتاج قوة حيود، وفي الخطوة الأخيرة، جمعت الأوتاد الصغيرة حيود البيانات، عادة دقة ± 5 ° التناوب، ومن كل موقف المختار. وقد أظهرت التجربة أن هذا النطاق تناوب يوفر كمية كافية من انعكاسات كل كريستال لمجموعة البيانات الجزئية تحجيم الأغراض، في الوقت نفسه، الحد من القضايا التوسيط كريستال ممكن وفرصة لفضح بلورات متعددة في 1من الدعم لا سيما مزدحمة. شرائح البيانات حيود الفردية (مجموعات البيانات الجزئية) ثم يتم معالجتها أما يدوياً أو باستخدام التجهيز الآلي للبيانات خطوط الأنابيب10،11،،من1213. لتحديد بنية المصب ثم اللازمة لإيجاد أفضل مزيج من مجموعات البيانات الجزئية أن تكون مدمجة14،،من1516 بعد التي يمكن علاجها مجموعة البيانات الناتجة بالكامل بنفس الطريقة كواحدة مصدرها تجربة بلورة الأحادية.
كمثال على ميشاندكوليكت في الممارسة، نقدم هنا الحل لهيكل كريستال أزرق سماوي الفلورسنت البروتين (CFP)، باستخدام مجموعة بيانات حيود شيدت من مجموعة جزئية من مجموعات البيانات التي تم جمعها من مجموعة من ميكروكريستالس شنت على نفس نموذج الدعم. قد تم تصميم أزرق من الأخضر الفلورسنت البروتين التجارة والنقل من قنديل البحر فيكتوريا أيكووريا17، الذين chromophore نيون أوتوكاتاليتيكالي يتكون من سيكليسيشن من ثلاثة متتالية من الأحماض الأمينية المخلفات. أزرق يتم الحصول عليها من التجارة والنقل بتحور البقايا الأولى والثانية في chromophore وسيرين وتيروزين، ثريونين (S65T) والتربتوفان (Y66W) على التوالي، وتكييف البيئة chromophore مع مزيد من الطفرات (Y145A، N146I، H148D، M153T و V163A) لإنتاج مستوى الأسفار هامة، ولكن دون الحد الأمثل لكي = 0.4918،،من1920. الخصائص الفلورية دون المستوى الأمثل من أزرق قد اقترحت أن تكون مرتبطة إلى ديناميات البروتين المعقدة التي تنطوي على استقرار ناقص واحد من أحد عشر بيتا-خيوط بروتين21 وإلى أماكن chromophore مختلفة اثنين ايزومرات تبعاً لظروف الأس الهيدروجيني وتشعيع22. لقد اخترنا العمل مع أزرق بروتين نموذجية التي توضح استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت المقرر أن سهولة نسبيا لضبط حجم البلورة تبعاً للبلورة. هيكل أزرق مشابهة جداً لأن في الأصل بروتين بروتينات فلورية خضراء، كما أنها تتألف من β-برميل مكونة من أحد عشر بيتا-خيوط المحيطة اللولب α، يحمل chromophore.
Protocol
Representative Results
Discussion
نجاح تجربة MX يتوقف عادة على وجود كبير نسبيا، كذلك ديفراكتينج بلورات. للمشاريع حيث يفشل الأمثل من الاستحمام كريستال صغيرة لبلورات أكبر، ميشاندكوليكت يوفر إمكانية الحصول على مجموعة بيانات حيود كاملة لهيكل الحل عن طريق المزيج من إيسومورفوس مجموعات البيانات الجزئية التي تم جمعها من سلسلة من بلورات صغيرة. الأسلوب متوافق مع بيملينيس السنكروتروني ل MX، مثالي مع تدفق فوتون عالية وقطرها شعاع صغيرة، مجهزة بأحدث جهاز ديفراكتوميتير وجهاز كشف قراءات سريعة. في هذه محطة نهاية، سيستغرق الجزء جمع البيانات من هذه التجربة حوالي 20 دقيقة، اعتماداً على العدد مجموعات البيانات الجزئية التي سيتم جمعها وعدد أصحاب العينة التي تحتوي على كريستال يتم تحليلها.
هو وجود عدد كاف من أهم شرطا أساسيا لنجاح تجربة ميشاندكوليكت (على الأقل 50، 100 مثالي) من ديفراكتينج مناصب على صاحب العينة. من الخبرة، ينبغي أن يكون الحد الأدنى لحجم البلورات إلى تحليل حوالي 5 ميكرومتر في البعد أصغر. الأسلوب متوافق مع أي نوع من البرد والتبريد قياسي متوافق عينة أصحاب مع أفضل النتائج ويجري تحقيقه باستخدام مش يتصاعد جامدة ومستقيمة.
وينفذ في أسرف، ميشاندكوليكت بطريقة سهلة الاستعمال في Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) سير عمل30 متاحة من برامج التحكم بيامليني MXCuBE2. ميزة كبيرة من ميشاندكوليكت مقارنة بالأساليب الأخرى SX هو أن البيانات التي يتم جمعها يمكن معالجتها بواسطة البرامج القياسية والآلي خطوط الأنابيب المستخدمة لبلورة أحادية الإرسال المتعدد.
كما يبين المثال الخاص بنا، فمن السهل جداً لتطبيق ميشاندكوليكت ويؤدي إلى سلسلة من مجموعات البيانات حيود الجزئية، وعادة ما تجمع من البلورات الصغيرة، التي يمكن دمجها لإنتاج مجموعة كاملة من البيانات لاستخدامها في بنية الحل. وعلاوة على ذلك، ميشاندكوليكت لديه القدرة على فتح مساحة أخذ العينات من البروتين البلوري حيث أنه يوفر وسيلة لجمع بيانات قابلة للاستخدام من المحاكمات تبلور فيها آخر خطوة التحسين، إنتاج بلورات كبيرة، غير ناجحة.
في ضوء التطورات الراهنة نحو أكثر إشراقا من مصادر الأشعة السينية (مثلاً، الغاية الرائعة المصدر (EBS) أسرف المشروع/35) فمن المنتظر أن سبب الضرر زيادة الإشعاع، يسرت نوع جمع البيانات متعددة الكريستال قبل ميشاندكوليكت سوف تصبح الطريقة القياسية لجمع البيانات، بدلاً من استثناء – كما الحال-في بياملينيس MX السنكروتروني القائم حاليا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر أسرف لتوفير الوقت شعاع من خلال برنامج البحوث الداخلية.
Materials
| Beamline | ESRF ID 23-1 | ||
| Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
| Crystallization plates XDXm with sealant | Hampton Research | HR3-306 | |
| EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | Life Technologies Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
| glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
| HEPES | Euromedex | 10-110-C | |
| His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13452-1KG | |
| MicroMeshes 700/25 | MiTeGen | SKU: M3-L18SP-25L | |
| NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P5413-500G | |
| Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
| Superdex 75 10/300 -GL | GE healthcare | 17-5174-01 | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Unipuck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Programs | |||
| ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
| aimless | MRC Laboratory of Molecular Biology | Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013). | |
| ccCluster | ESRF | Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). | local development |
| DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
| MeshAndCollect workflow | ESRF | Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). | local development |
| MXCuBE2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). | local development |
| XDS | Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung | Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010) |
References
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
- Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
- Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
- Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
- Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
- Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
- Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
- Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
- Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
- Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
- Rhodes, G. . Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
- De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
- Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
- Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
- Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
- Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
- Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 – 2022). The orange book. , (2015).
