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Biochemistry

Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

Published: March 19, 2019
doi:
10.3791/58594
, , , , , , , ,
1European Synchrotron Radiation Facility,Structural Biology Group, 2European Molecular Biology Laboratory, 3Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS (Institut de Biologie Structurale)

Summary

Apresentamos o uso do protocolo de MeshAndCollect para obter um conjunto de dados de difração completa, para uso na determinação da estrutura subsequente, composto de difração parcial de conjuntos de dados coletados de muitos pequenos cristais de proteína fluorescente Azul cerúleo.

Abstract

Cristalografia de raios x é a principal técnica usada para obter informações de alta resolução relativa as 3-dimensional estruturas de macromoléculas biológicas. Até recentemente, um requisito importante tem sido a disponibilidade de relativamente grande, bem diffracting cristais, que muitas vezes são difíceis de obter. No entanto, o advento da cristalografia serial e um renascimento em métodos de recolha de dados multi cristal significou que a disponibilidade de grandes cristais não precisa mais ser um fator limitante. Aqui, nós ilustram o uso do protocolo de MeshAndCollect automatizado, que primeiro identifica as posições de muitos cristais pequenos montados na mesma porta-amostras e então direciona a coleção de cristais de uma série de conjuntos de dados de difração parcial para fusão posterior e uso na determinação da estrutura. MeshAndCollect pode ser aplicado a qualquer tipo de microcristais, mesmo se diffracting fracamente. Como exemplo, apresentamos aqui o uso da técnica para resolver a estrutura de cristal de Cerulean a proteína fluorescente ciano (PCP).

Introduction

Macromolecular cristalografia de raios x (MX) é, de longe, o método mais utilizado para obter insights sobre resolução atômica as estruturas tridimensionais de macromoléculas biológicas. No entanto, um principais estrangulamentos é a exigência de cristais relativamente grandes, bem diffracting.

Muitas vezes e, em especial quando a cristalização de proteínas de membrana, apenas muito pequenos cristais de alguns mícrons na dimensão maior podem ser obtidos. Danos de radiação efeitos fixado a resolução de um dados de difração completa que pode ser coletado de um único micro cristal2e muitas vezes, é necessário melhorar a relação sinal / ruído e, portanto, dados definir a resolução, mesclando vários conjuntos de dados de difração parcial de cristais diferentes, mas isomórficos. O aumento na densidade de fluxo de feixes de raios-x em fontes síncrotron e em outros lugares (por exemplo, raios-x elétrons livres lasers (X-FELs)), significaram que os conjuntos de dados de difração parcial úteis podem ser coletados de cristais mesmo muito pequenos de biológicas macromoléculas. Isto, por sua vez, levou ao desenvolvimento de novas técnicas para a recolha e fusão parcial difração conjuntos de dados coletados de muitos cristais diferentes a fim de produzir um conjunto de dados completo para solução de estrutura. Tais técnicas são comumente referidas como serial cristalografia (SX)3,4,5,6,7,8. Um exemplo prototípico de SX é o uso de dispositivos de injector de introduzir um riacho estreito de chorume um cristal o feixe de raio-x3,4,5. Um padrão de difração é registrado toda vez que um cristal é exposto a raios-x, levando à coleção, de muitos milhares de cristais individuais, de ‘ainda’ imagens de difração, informação que é, então, fundiu-se para produzir um conjunto de dados completo. No entanto, uma desvantagem considerável deste tipo de coleta de dados serial é que o processamento de imagens estáticas pode ser problemático. A qualidade de dados é consideravelmente melhorada se cristais podem ser girados e/ou várias imagens de difração são recolhidas a partir do mesmo cristal durante experimentos de cristalografia série6.

MeshAndCollect1 foi desenvolvido com o objetivo de combinar SX com coleta de dados de rotação MX ‘padrão’ e permite, de forma automática, experimentadores para coletar os conjuntos de dados de difração parcial de numerosos cristais do mesmo destino macromolecular montado sobre os suportes de amostra iguais ou diferentes. Um conjunto de dados de difração completa é então obtido mesclando-se o mais isomórfica os parciais de conjuntos de dados coletados. MeshAndCollect é compatível com qualquer trajetória de raio-x do síncrotron de estado-da-arte para MX (idealmente uma instalação de dispositivo de inserção com um relativamente pequeno (20 µm ou menos) tamanho na posição de amostra do feixe). Além a compilação completas de conjuntos de dados de uma série de cristais pequenos, bem diffracting, o método também é muito apropriado para a avaliação inicial e experimental da qualidade difração de microcristais de e para o processamento de amostras opacas, por exemplo, no meso crescido microcristais de membrana proteínas9.

No início de um experimento de MeshAndCollect, as posições, em duas dimensões, de cada um dos muitos cristal contido em um suporte de amostra única são determinadas usando um exame de raio-x de baixa dose. As imagens de difração coletadas durante esta verificação são automaticamente analisadas pelo programa DOZOR1, que classifica as posições dos cristais no suporte da amostra de acordo com sua força de difração respectivos. Posições para a coleção de conjuntos de dados parciais são atribuídas automaticamente com base em um limite de resistência de difração e, na última etapa, pequenas cunhas de dados de difração, tipicamente de ± 5 ° de rotação, são coletadas de cada posição escolhida. A experiência demonstrou que esta gama de rotação fornece uma quantidade suficiente de reflexões por cristal para conjunto de dados parcial dimensionamento fins, enquanto ao mesmo tempo, reduzindo a centralização questões possíveis de cristal e a oportunidade de expor vários cristais em um particularmente cheio de suporte1. As cunhas de dados individuais de difração (conjuntos de dados parciais) são então processados ou manualmente ou usar o tratamento automatizado de dados gasodutos10,11,12,13. Para determinação da estrutura a jusante é então necessário encontrar a melhor combinação parciais de conjuntos de dados a ser mesclada14,15,16 , após o qual o conjunto de dados completo resultante pode ser tratado da mesma forma como uma proveniente de um experimento de cristal único.

Como um exemplo de MeshAndCollect, na prática, apresentamos aqui a solução da estrutura de cristal de Cerulean a proteína fluorescente ciano (PCP), usando um conjunto de dados de difração construído a partir da combinação parciais de conjuntos de dados coletados de uma série de microcristais montagem sobre o mesmo suporte de amostra. Cerúleo foi projetado da proteína fluorescente verde (GFP), da água-viva Aequorea victoria17, cujo cromóforo fluorescente autocatalytically é formado a partir da ciclização de três resíduos de aminoácidos consecutivos. Cerúleo é obtido a partir de GFP em mutação resíduos de primeiro e segundo o cromóforo, uma serina e uma tirosina, treonina (S65T) e triptofano (Y66W) respectivamente e adaptando o ambiente cromóforo com novas mutações (Y145A, N146I, H148D, M153T e V163A) para produzir um nível de fluorescência significativa, no entanto, de qualidade inferior de QY = 0.4918,19,20. As propriedades fluorescentes suboptimal de Cerulean têm sido propostas para ser ligada à dinâmica de proteína complexa envolvendo a imperfeita estabilização de uma das onze β-costas da proteína21 e para a acomodação de dois diferentes cromóforo isômeros, dependendo do pH e irradiação condições22. Optamos por trabalhar com Cerulean como uma proteína de modelo ilustrando o uso do protocolo de MeshAndCollect devido ao relativamente facilidade de ajuste de tamanho de cristal, dependendo a cristalização. A estrutura de Cerulean é muito semelhante ao que de sua proteína pai GFP, como é constituído de um β-barril formada de onze β-vertentes rodeia uma α-hélice, que ostenta o cromóforo.

Protocol

1. expressão e purificação de Cerulean Nota: Isto é baseado no protocolo publicado por Lelimousin et al . 21 Express com sua tag Cerulean em Escherichia coli BL21 células cultivadas a 37 ° C em 4 L de auto inducible médio23 até OD600= 1 e então incubar durante uma noite a 27 ° C. Colheita de células bacterianas a 5.000 x g e lisar a células através do sonication (40%, 5 min, 10 pulso s, pausa de s 10) em 200 mL de tampão composto de 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl e 1 x livre de EDTA inibidores de protease. Carregar o sobrenadante em uma coluna de sua armadilha Ni-NTA e eluir Cerulean com imidazol 100 mM nas mesmas condições de reserva. As frações de cores amarelas brilhantes da piscina. A proteína é intrinsecamente colorida, daí as frações que contêm Cerulean são facilmente distinguíveis. Purifica a proteína (4 mL) em uma coluna de S75 em 20 mM Tris de pH 8.0. As frações de amarelas brilhantes da piscina e concentrar a solução da proteína para 15 mg/mL. 2. cristalização Use o drop de enforcamento difusão técnica24 a 20 ° C em placas de Linbro de vapor. Encher os poços com 1 mL de uma solução precipitant consistindo de 100 mM HEPES pH 6,75, 12% PEG8000 e 100 mM MgCl2. Para as gotas de enforcamento, misture 1 µ l de proteína concentrada a 15 mg/mL com 1 µ l de solução precipitant. Cristais devem aparecer em 24h. Os cristais obtidos de colheita e transferência para 100 µ l de um buffer de semeadura compostas de 0,1 M pH HEPES 6,75, 22% PEG 8000. Moer os cristais com um moedor de tecido de 0,1 mL e diluir em semeadura tampão (relação 1: 100). Digeri uma alíquota da solução da proteína estoque (15 mg/mL) com tripsina (0,5 mg/mL, a mesma reserva) por 1h (01:10 (v/v)). Misturar a solução de proteína digerida com 10% de sementes contendo tampão (v/v). Crescer cristais (10 * 10 * 20 µm3) em 0,1 M pH HEPES 7, 14% PEG 8000, 0.1 MgCl2 em suspensão de 1-1,5 μL gotas usando o método de difusão de vapor. 3. cristal montagem Use um loop apropriado, por exemplo, uma malha 700 quadrados falhas de 25 µm cada montado em uma amostra-padrão de espinha titular25. Transferi os cristais da lista suspensa de cristalização (passo 2.6) em 1 µ l de solução crioprotetoras (a solução bem precipitant misturada com glicerol (20% v/v final)). Monte o chorume de cristal da proteína em um loop de malha movendo o loop sob os cristais e levantando-os fora da gota. Idealmente, os cristais devem ser na faixa de tamanho de 5 µm – 30 µm em dimensão máxima com nenhuma sobreposição entre cristais montado no loop. Pavio do excesso de líquido por tocar o Monte rapidamente com papel de filtro. Sedimentos os cristais para que sentam-se no plano do loop rodeado por tão pouco em massa de líquido possível. Mergulhe o monte um unipuck cheio de nitrogênio líquido. Armazene o disco a 100 K em um recipiente de armazenamento adequado até tempo de feixe está disponível. 4. offline preparação do experimento síncrotron Nota: Solicitar tempo síncrotron feixe tão cedo quanto possível e siga as orientações on-line para tipos de acesso disponíveis e sobre como submeter um pedido de um determinado síncrotron. As diretrizes ESRF podem ser encontradas em http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Se um membro de um grupo de alocação de bloco ESRF (saco), um aplicativo para cada projeto específico não é necessário. Neste caso, experimentadores devem abordar seu saco responsável sobre a programação de tempo de feixe. Depois que a proposta é aceita e é recebido um convite para o experimento, ter todos os participantes completar o treinamento de segurança. Preencha a “A forma” (através do portal do usuário ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) com as informações de segurança exigidas nas amostras. Entrar em contato com a pessoa de contacto local para discutir a experiência. Uma vez que seu uma-forma é apresentada e validada ele vai te dar o número do experimento e a senha. Conectar-se a estendida ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) e escolha o MX. Fazer login com o número do experimento e a senha a partir de uma-forma. Selecionar remessa | Adicionar novo e preencha as informações solicitadas. Selecione Adicionar parcela e preencha os dados relevantes. Selecione Adicionar Container, escolha um unipuck e preencha as informações necessárias, incluindo as posições dos titulares amostra no puck. 5. carregamento da amostra em uma trajetória No hutch experimental, carregar o disco para o trocador de amostra (SC) dewar e observe a sua posição. Bloqueiam a cabine experimental e insira o hutch de controle. Acesse o ISPyB (https://esrf.fr/). Selecione a Experiência de preparar, encontrar o carregamento, selecione próximo e indicar a trajetória e a posição do disco em SC. Logar no software de controle de trajetória, aqui MXCuBE227,28 com o número experimental e a senha fornecidos a uma-forma. Pressione Sync para sincronizar o software de controle de trajetória com Banco de dados ISPyB. Use o software de controle de trajetória, para montar o porta-amostras para o goniômetro. No MXCuBE2, clique uma posição na área de trocador de amostra e selecionar Amostra de montagem. Aproveitando o MK3 kappa mini goniômetro29 instalado no máximo da ESRF MX de Luz Síncroton, uso “realinhamento visual” fluxo de trabalho de30 do MXCuBE2 para alinhar o avião do porta-amostras com o eixo de rotação do goniômetro. Selecione o botão de Centro , centro 3 em seguida, clique no meio da borda da ponta do loop. Salve a posição centrada selecionando salvar. Clique novamente no botão Centro , centro 3 em seguida, clique no meio do início da haste do loop. Salve a segunda posição também clicando em salvar. Selecione um dos salvos centrado posições clicando nele. Sob avançado, adicione o fluxo de trabalho Visual reorientação para a fila de coleta de dados MxCuBE2. Inicie o fluxo de trabalho clicando em coletar fila. Depois que o fluxo de trabalho alinha o plano do porta-amostras com o eixo de rotação do goniômetro, centro do porta-amostras novamente, desta vez em algum lugar no meio da malha. Oriente o porta-amostras de modo que a face da malha é perpendicular à direção do feixe de raios-x, girando o eixo ômega usando MXCuBE2. Em MXCuBE2, selecione o tamanho de feixe, necessário para a digitalização do porta-amostras (somente para Luz Síncroton, com tamanho variável de feixe). Clique em abertura menu drop-down do software de controle de trajetória e selecionar um valor, por exemplo, 10 µm. Defina uma malha para a verificação de malha. Clique no ícone de ferramenta malha em MXCuBE2. Aparecerá a janela de ferramenta de malha. Na exibição de amostra de MXCuBE2, desenhe a malha deixou clicando e arrastando o mouse sobre a área que contém cristais no porta-amostra. Para salvar a malha clique no botão Plus na janela de ferramenta de malha (engranzamento torna-se verde). 6. preparar e executar o fluxo de trabalho MeshAndCollect No campo de resolução de MXCuBE2, digite a resolução (d.min) no qual difração imagens deverão ser recolhidas, por exemplo, aqui 1,8 Å. Selecione MeshAndCollect na guia de coleta de dados avançado , adicioná-lo para a fila e clique em recolher a fila. Na janela de parâmetro que aparece, use os parâmetros padrão dependente de trajetória. No experimento aqui descrito padrões parâmetros são o tempo de exposição 0.037 s por ponto de exame de malha, 100% de transmissão (levando neste caso a 4 x 1011 ph/s), oscilação de 1 ° por linha de varredura de malha. Clique em Ccontinuar. Executa a verificação de malha e as imagens de difração, coletadas em cada ponto de grade são analisadas e classificadas de acordo com a força de difração com o software DOZOR1. Este processo é executado em segundo plano. Após a análise DOZOR um mapa de calor é gerado e a ordem para coletas de dados subsequentes parcial é atribuída automaticamente com base na força de difração (veja a Figura 1).Nota: Os resultados desta etapa também podem ser inspecionados em ISPyB. Para a coleção de conjuntos de dados parciais, que uma nova aba com configurações aparece no software de controle de trajetória, selecione valores adequados para a faixa de rotação (ou seja, 0,1 °), número de imagens (ou seja, 100), tempo de exposição, resolução, transmissão, inversa feixe etc idealmente a dose para cada Cunha a recolher deve estar abaixo do limite de Garman (30 MGy). O tempo de exposição aproximada por imagem é 0.037 s a 0,1 s em condições experimentais descritas. Clique em continuar para lançar as coleções de dados parciais. 7. processamento de dados Nota: Os conjuntos de dados parciais são integrados com um programa apropriado (XDS10). Por isso um script Python será usado que reconhece cada conjunto de dados individual, integra e certifica-se de que a indexação entre os diferentes conjuntos de dados parciais é consistente. Abra a pasta que contém as imagens: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean. Faça uma cópia de segurança da subpasta processo que pode ser encontrada na pasta onde os conjuntos de dados parciais são coletados. No terminal Linux, use o comando cp-r process_backup de processo. Navegue para a pasta de processo e iniciar o script de processamento. No terminal Linux, digite o comando cd processo e tecle enter. Tipo procMultiCrystalData e tecle enter.Nota: O script irá pedir a um grupo de espaço e parâmetros de célula (esta informação é opcional), digite aqueles de acordo com as instruções. Depois de uma última confirmação do usuário, o script será executado automaticamente. 8. fusão de conjuntos de dados Nota: Depois de todos os conjuntos de dados parciais são integrados a melhor combinação deles são mescladas para produzir o conjunto de dados final para uso na determinação da estrutura e requinte. Diferentes objectivos deste processo de fusão podem ser obter total completude (altamente recomendado), multiplicidade de alta ou as melhores estatísticas de dados (alta , R-fatores de baixas, etc.). Este último pode às vezes ser à custa de exaustividade e/ou multiplicidade então esta opção deve ser escolhida com cuidado. Mescle os conjuntos de dados parciais, usando o programa ccCluster14. Ele usa análise de Cluster hierárquico (HCA) para determinar as combinações possíveis de conjuntos de dados parcial isomórfica (). Digite ccCluster no terminal Unix para abrir sua interface de usuário gráfica (GUI).Nota: O GUI ccCluster uma dendrograma é desenhada. Isto dá uma sugestão sobre qual parcial de conjuntos de dados podem ser melhor fundiu-se com base em isomorfismo entre eles. Clique em um nó que corresponde a um valor de cerca de 0,4 no eixo vertical. Geralmente, valores superiores incluirá dados mais parciais de moda mas leva a pior mesclando estatísticas como conjuntos de dados parciais será menos isomórfica. Clique em mesclar dados. O cluster selecionado será processado em segundo plano e as estatísticas se fundem estimadas aparecerá em uma nova aba no GUI. Este passo pode ser repetido para diferentes combinações de conjuntos de dados. Para uma boa combinação de conjuntos de dados parciais a integralidade deve ser próximo de 100%, o valores elevados (10 ou superior na camada mais baixa resolução) e os valores de31 R-meas baixa (cerca de 5% na camada de baixa resolução). Para cada combinação selecionada, use o script de entrada gerado para mesclar os conjuntos de dados parciais, escolhidos em um arquivo único mtz (ou seja, sem sentido de32). Definitivamente de escala e mesclar os dados de intensidade neste arquivo usando um programa de escala (ou seja, sem rumo32) e, como com um arquivo originário de uma coleta de dados de cristal único, use a saída para posterior eliminação e estrutura solução33 .

Representative Results

MeshAndCollect, conforme implementado no MXCuBE2 (ver figura 1A), foi usado para a coleção de conjuntos de dados de difração parcial de pequenos cristais de Cerulean localizado na mesma porta-amostras em que a identificação visual dos cristais foi difícil. Para o porta-amostras de tela, desenhamos uma grade sobre o centro da meshloop (ver figura 1B) e baseia o DOZOR Pontuação calor mapear difração de parcial 85 (ver figuras 1, 1D), conjuntos de dados foram coletados automaticamente. Estas foram integradas individualmente, em seguida, mescladas (veja acima) para produzir um conjunto de dados com integridade de 99,8% dmin = 1.7Å (ver tabela 1). Meia-conjunto correlação (CC1/2)34 na camada de resolução mais alta foi de 60% (= 4.7). Como esperado, a estrutura de cristal de Cerulean poderia ser resolvida direta por substituição molecular33 usando o conjunto de dados gerado. Após o refinamento, obtivemos um Rtrabalhar de 22,8% e um Rlivre de 25,4%. Superposição com a estrutura previamente determinada (PDB entrada 2WSO21) mostra uma rmsd global Cα posições de 0.1 Å. Estatísticas do conjunto de dados mesclado Limiar de clustering 0.35 Número de conjuntos de dados parciais 25 Grupo de espaço P212121 Célula unitária (a, b, c) 50.98, 62.76, 69,50 Gama de resolução 46,58-1,70 (1.73-1.70) Rmerge (todos eu + e -) 0.133 (0.743) Rmeas (todos eu + & eu-) 0,142 (0.813) Rpim (todos eu + & eu-) 0,047 (0.318) Total de observações/exclusivo 220693/25129 Mean((I)/SD(I)) 13,8 (4.7) Correlação de metade-conjunto MN(I) CC(1/2) 0.994 (0.602) Completude 99.8 (99,5) Multiplicidade 8.8 (6.5) Final Rcryst 22,8 Final Rgrátis 25.4 Tabela 1: Estatísticas do conjunto de dados resultante, indicando a alta qualidade dos dados coletados. Figura 1: usando MeshAndCollect para coletar uma série de conjuntos de dados parciais de uma série de pequenos cristais contidos no mesmo porta-amostra. A)-interface do usuário do MXCuBE2. O verde oval sobre o campo de visualizador no eixo indica a ferramenta grade. B) com isso uma grade é desenhada sobre a imagem do porta-amostras no campo de imagem de vida. Mapa C) calor das pontuações DOZOR. D) exemplo de uma imagem de difração. E) dendrograma após a análise de agrupamento hierárquico. Conjuntos de dados em vermelho foram usados para mesclar. F) estrutura total de Cerulean. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O sucesso de um experimento de MX geralmente depende da existência de relativamente grande, bem diffracting cristais. Para projetos onde a otimização dos chuveiros de cristal pequeno de cristais maiores falha, MeshAndCollect oferece a possibilidade de obter um conjunto de dados de difração completa para estrutura solução através da combinação isomórfica parciais de conjuntos de dados coletados de uma série de pequenos cristais. O método é compatível com o de luz síncroton síncrotron para MX, idealmente com um fluxo de fótons de alta e um diâmetro pequeno feixe, equipado com um dispositivo de Difratômetro de última geração e um detector de rápido-leitura. Em tal uma estação final, a parte de coleta de dados de tal experiência terá cerca de 20 minutos, dependendo do número parciais de conjuntos de dados a serem coletados e o número de cristal contendo os titulares de amostra a analisar.

O mais importante pré-requisito para o sucesso de um experimento de MeshAndCollect é a existência de um número suficiente (pelo menos 50, 100 idealmente) de diffracting posições no suporte da amostra. Da experiência, o tamanho mínimo dos cristais para ser analisado deve ser cerca de 5 µm em dimensão menor. O método é compatível com qualquer tipo de padrão compatível com cryo-resfriamento titulares da amostra com os melhores resultados alcançados usando malha as montagens que são rígidas e retas.

Na ESRF, MeshAndCollect é implementado de forma amigável em uma Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) de fluxo de trabalho30 disponível a partir do software de controle de trajetória de MXCuBE2. Uma grande vantagem do MeshAndCollect em comparação com outros métodos SX é que os dados coletados podem ser processados por programas padrão e automatizado dutos utilizados para o MX de cristal único.

Como mostra o nosso exemplo, MeshAndCollect é muito fácil de aplicar e leva a uma série de conjuntos de dados de difração parcial, geralmente coletadas de pequenos cristais, que podem ser mesclados para produzir um conjunto de dados completo para uso em solução de estrutura. Além disso, MeshAndCollect tem o potencial para abrir o espaço de amostragem de cristalografia de proteínas que fornece uma maneira de coletar dados utilizáveis de ensaios de cristalização, onde a última etapa de otimização, a produção de grandes cristais, for bem sucedida.

À luz dos desenvolvimentos atuais para fontes de raio-x mais brilhantes (por exemplo, fonte extremamente brilhante (EBS) projeto/ESRF35) é previsível que, devido a danos de radiação aumentada, o tipo de coleta de dados multi cristal facilitada por MeshAndCollect vai se tornar o método padrão de coleta de dados, em vez de uma exceção – como é actualmente o caso – no baseados em síncrotron MX de luz síncroton.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a ESRF para fornecer tempo de feixe através de seu programa de pesquisa.

Materials

Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)
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References

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. . Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 – 2022). The orange book. , (2015).

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Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).
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