Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo
Summary
Descriviamo i metodi per l’etichettatura fluorescente di tangenzialmente migrazione cellule mediante elettroporazione e per l’imaging di time-lapse del movimento cellulare con etichetta in una cultura di piatto-Monte al fine di visualizzare la migrazione delle cellule comportamento nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo .
Abstract
Time-lapse imaging è un potente metodo per analizzare il comportamento di migrazione delle cellule. Dopo d’etichettatura delle cellule fluorescenti, il movimento delle cellule con etichettate nella cultura può essere registrato sotto video microscopia. Per l’analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è comunemente usato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare radiale. Tuttavia, limitati informazioni possono essere ottenute dal metodo di cultura slice per analizzare la migrazione cellulare perpendicolare alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare tangenziale. Qui, presentiamo i protocolli per time-lapse di imaging per visualizzare la migrazione cellulare tangenziale nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Una combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovo e una successiva cultura di piatto-Monte sull’inserto di cultura cellulare consente il rilevamento di movimento di migrazione cellulare nel piano orizzontale. Inoltre, il nostro metodo facilita il rilevamento del comportamento delle singole celle e l’azione collettiva di un gruppo di cellule a lungo termine. Questo metodo può essere applicato potenzialmente per rilevare la modifica sequenza della fluorescente-etichetta micro-struttura, compreso l’allungamento assonale nello spostamento dei tessuti o cellule neurale nel tessuto non neurali.
Introduction
Lo studio della migrazione cellulare è proseguito con la tecnica avanzata di imaging dal vivo. Dopo d’etichettatura delle cellule fluorescenti, l’andamento temporale delle cellule con etichettate in una piastra di coltura o in vivo può essere registrato sotto video microscopia. Nello studio dello sviluppo neurale, i cambiamenti morfologici della migrazione di cellule o allungando gli assoni sono stati analizzati usando la formazione immagine di time-lapse. Per l’imaging efficace, è indispensabile applicare un metodo adatto per la preparazione di etichettatura ed il tessuto delle cellule fluorescenti, basata allo scopo dell’esperimento e analisi. Per l’analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è stato comunemente utilizzato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come cellula radiale migrazione1,2,3. Il sistema di cultura fetta è usato anche per la rilevazione di cellule tangenziale migrazione4,5, ma non è adatto per analisi direzionale in casi dove le cellule disperdono perpendicolare alla sezione fetta.
Il tectum ottica è composta da una struttura multistrata, formata da migrazione di cellule radiali e tangenziali durante lo sviluppo embrionale. Formazione dello strato tectal dipende in primo luogo radiale migrazione delle cellule postmitotic precursori neuronali dalla zona ventricolare e destinazione finale negli strati correla con la loro data di nascita in zona ventricolare6. Per quanto riguarda la migrazione tangenziale, precedentemente abbiamo segnalato due flussi di migrazioni negli strati medio e superficiale in un tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Negli strati medio durante E6-E8, le cellule bipolari con un processo a lungo leader e un sottile processo finale migrano dorsalmente o ventralmente lungo il fasciculus assone di tectal assoni efferenti che eseguire dorso-ventralmente7. Dopo questa migrazione di axophilic, le cellule si differenziano in neuroni multipolari situati negli strati profondi. Negli strati superficiali durante E7-E14, le cellule migranti disperdono orizzontalmente riformando un processo leader ramificato e dispersione in più direzioni8. Dopo la dispersione di migrazione, le cellule di quest’ultime alla fine differenziano in neuroni superficiali delle varie morfologie. In entrambi i casi, una cultura di piatto-mount è efficiente per osservare il movimento delle cellule parallela alla superficie pial.
Qui, presentiamo un protocollo per time-lapse imaging per visualizzare migrazione tangenziale delle cellule in via di sviluppo pulcino tectum ottica7,8. Combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovoe una successiva cultura di piatto-Monte sull’inserto di cultura cellulare consente di rilevamento della direzione di movimento e migrazione delle cellule la migrazione. L’obiettivo di questo metodo è quello di facilitare l’individuazione di sia il comportamento delle singole celle a lungo termine e l’azione collettiva di un gruppo di cellule nel piano orizzontale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per il rilevamento di migrazione cellulare in strati superficiali6,8. È applicabile per la rilevazione di strato intermedio migrazione flussi (film 5)6,7, solo da spostando la tempistica dell’elettroporazione (5,5 a E4.5) e l’inizio della cultura e imaging (E7.0 a E6.0).
La procedura presentata è …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da JSP KAKENHI Grant numero 15K 06740 a Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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