Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum
Summary
Wir beschreiben die Methoden für die fluoreszierenden Kennzeichnung von tangential Migration Zellen durch Elektroporation und für Zeitraffer-Aufnahmen von der markierten Zelle Bewegung in einer Wohnung-Mount-Kultur um die Migration zu visualisieren Zelle Verhalten in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum .
Abstract
Zeitraffer-Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode, wandernde Zelle Verhalten zu analysieren. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die Bewegung der markierten Zellen in Kultur unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, ist Stück Kultur verbreitet Zellwanderung parallel zum Abschnitt Slice wie radial Zellwanderung beobachten. Die Slice-Kultur-Methode Zellwanderung senkrecht zur Scheibe Abschnitt, z. B. tangentiale Zellwanderung analysieren kann jedoch nur begrenzte Informationen einzuholen. Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum. Eine Kombination aus Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovo und eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht eine Erfassung der wandernde Zelle Bewegung in der horizontalen Ebene. Darüber hinaus ermöglicht unsere Methode Erkennung der einzelnen Zelle Verhalten und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen auf lange Sicht. Diese Methode kann potenziell angewendet werden, um die sequenzielle Änderung der Leuchtstofflampen-mit der Bezeichnung Mikro-Struktur, einschließlich der axonalen Dehnung in die neuronale Gewebe oder Zellen Verschiebung im nicht-neuronale Gewebe zu erkennen.
Introduction
Mit der fortschreitenden Technik live Imaging hat das Studium der Zellmigration voran. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die zeitliche Bewegung der markierten Zellen in einer Kulturschale oder in Vivo unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. In der Studie der neuronalen Entwicklung wurden die morphologische Veränderungen der Zellen migrieren oder verlängern Axone mit Zeitraffer Bildgebung analysiert. Für effektive Belichtung ist es wichtig, eine geeignete Methode für fluoreszierende Zelle Kennzeichnung und Gewebe Zubereitung, basierend auf dem Zweck des Experiments und Analyse anwenden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, wurde Slice Kultur allgemein zur Zellwanderung parallel zur Scheibe Abschnitt, z. B. radial Zelle Migration1,2,3beobachten. Die Slice-Kultur-System dient auch zur Erkennung von tangentialen Zelle Migration4,5, aber es ist nicht geeignet für die gerichtete Analyse in Fällen, wo die Zellen senkrecht zum Abschnitt Slice zerstreuen.
Die optic Tectum besteht aus einer vielschichtigen Struktur, gebildet durch radial und tangential Zellwanderung während der Embryonalentwicklung. Tectal Schichtausbildung hängt vor allem von radialen Migration der postmitotischen neuronalen Vorläuferzellen aus der ventrikulären Zone, und ihren endgültigen Bestimmungsort in den Schichten korreliert mit ihr Geburtsdatum in der ventrikulären Zone6. Für tangentiale Migration berichteten wir bereits zwei Ströme von Migrationen in den mittleren und oberflächlichen Schichten in einem entwickelnden Küken optic Tectum. In den mittleren Schichten während E6-E8 migrieren die bipolaren Zellen mit eine lange führende Prozess- und einen dünnen nachgestellten Prozess dorsal oder ventral entlang den Axon Fasciculus tectal ableitenden Axone, die dorsal-ventral7ausgeführt. Nach dieser Axophilic Migration differenzieren die Zellen multipolare Nervenzellen befindet sich in den tieferen Hautschichten. In den oberflächlichen Schichten während E7-E14 zerstreuen die Migration von Zellen horizontal durch eine verzweigte führende Prozess- und Streuung in mehrere Richtungen8zu reformieren. Nach der Migration zu dispergieren, differenzieren die letzteren Zellen schließlich oberflächliche Neuronen von verschiedenen Morphologien. In beiden Fällen ist eine Wohnung-Mount Kultur effizient, Zelle Bewegung parallel zur pial Oberfläche zu beobachten.
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in Entwicklungsländern Küken optic Tectum7,,8. Kombination von Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovound eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht Richtungserkennung wandernde Zelle Bewegung und Migration. Das Ziel dieser Methode ist es, Aufdeckung von sowohl einzelnen Zelle Verhalten langfristig und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen in der horizontalen Ebene zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Protokoll ist für die Erkennung von Zellwanderung in oberflächlichen Schichten6,8optimiert. Es ist anwendbar für die Erkennung von Mittelschicht Migration Bäche (Movie 5)6,7, nur durch Verschieben der Zeitplan für die Elektroporation (E5.5, E4.5) und dem Beginn der Kultur und Bildgebung (E7.0, E6.0).
Das vorgestellte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI Grant-Nummer 15K 06740, Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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