Summary

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Published: October 24, 2018
doi:

Summary

We beschrijven de methoden voor het labelen van fluorescerende tangentieel migreren cellen door electroporation, en voor time-lapse beeldvorming van de beweging van de gelabelde cel in een flat-mount cultuur om te visualiseren migreren cel gedrag in de ontwikkelingslanden chick optic tectum .

Abstract

Time-lapse imaging is een krachtige methode om te migreren cel gedrag te analyseren. Na tl cel labeling, kan het verkeer van de gelabelde cellen in cultuur onder videomicroscopie worden opgenomen. Voor het analyseren van cel migratie in de ontwikkelende hersenen, wordt segment cultuur vaak gebruikt om te observeren cel migratie parallel aan de sectie van het segment, bijvoorbeeld radiale cel migratie. Echter kan beperkte informatie worden verkregen door de methode voor het analyseren van cel migratie loodrecht op de sectie van het segment, bijvoorbeeld tangentiële cel migratie segment cultuur. Hier presenteren we de protocollen voor time-lapse denkbaar om te visualiseren tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden chick optic tectum. Een combinatie van cel labeling door electroporation in ovo en een daaropvolgende flat-mount cultuur op de cel cultuur invoegen maakt detectie van migreren cel beweging in het horizontale vlak. Bovendien vergemakkelijkt onze methode detectie van zowel individuele cel gedrag en de collectieve actie van een groep cellen op de lange termijn. Deze methode kan mogelijk worden toegepast om te ontdekken de sequentiële verandering van de TL-geëtiketteerden micro-structuur, met inbegrip van de axonale rek in de neurale verplaatsing van de weefsels of cellen in de niet-zenuwweefsel.

Introduction

De studie van cel migratie heeft voortgang met de oprukkende techniek voor levende imaging. Na tl cel labeling, kan het tijdelijke verkeer van gelabelde cellen in een cultuur schotel of in vivo onder videomicroscopie worden opgenomen. In de studie van neurale ontwikkeling, hebben de morfologische veranderingen van cellen migreren of grondvlak axonen zijn geanalyseerd met behulp van time-lapse imaging. Voor effectieve beeldvorming is het essentieel een geschikte methode voor fluorescerende cel labeling en weefsel preparaat, gebaseerd op het doel van het experiment en de analyse toe te passen. Voor het analyseren van cel migratie in de ontwikkelende hersenen, heeft segment cultuur zijn gebruikte om te observeren cel migratie parallel aan de sectie van het segment, bijvoorbeeld radiale cel migratie,1,,2,3. Het segment cultuur systeem wordt ook gebruikt voor het opsporen van tangentiële cel migratie4,5, maar het is niet geschikt voor directionele analyse in gevallen waar de cellen loodrecht naar de segment-sectie verspreiden.

De optische tectum bestaat uit een meerdere lagen structuur, gevormd door radiaal en tangentieel cel migratie tijdens de embryonale ontwikkeling. Tectal laag vorming is voornamelijk afhankelijk van radiale migratie van neuronale voorlopercellen van de ventriculaire zone postmitotic, en hun eindbestemming in de lagen correleert met hun geboortedatum in de ventriculaire zone6. Wat betreft de tangentiële migratie meldden we eerder twee stromen van migraties in de oppervlakkige en middelste lagen in een derde kuiken optic tectum. In de middelste lagen tijdens E6-E8 migreren de bipolaire cellen met een lange leidende proces en een dunne achterstand proces dorsally of ventrally langs de axon arcuatus van tectal efferent axonen uitvoert dorso-ventrally7. Na de migratie van deze axophilic onderscheiden de cellen in de multipolaire neuronen zich in de diepe lagen. In de oppervlakkige lagen tijdens E7-E14 verspreiden de migreren cellen horizontaal door de hervorming van een vertakte leidende proces en scatter in meerdere richtingen8. Na de migratie te verspreiden, onderscheiden de laatstgenoemde cellen uiteindelijk in oppervlakkige neuronen van verschillende morphologies. In beide gevallen is een flat-mount cultuur efficiënt om te observeren cel beweging parallel aan het pial oppervlak.

Hier presenteren we een protocol voor time-lapse denkbaar om te visualiseren tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden chick optic tectum7,8. Combinatie van cel labeling door electroporation in ovo, en een latere flat-mount cultuur op de cel cultuur invoegen maakt detectie van migreren cel verkeer en migratie richting. Het doel van deze methode is om de detectie van zowel individuele cel gedrag in de lange termijn en de collectieve actie van een groep cellen in het horizontale vlak.

Protocol

1. Electroporation In Ovo Voorbereiden op de expressie plasmide DNA fluorescerende labeling in hoge concentratie. Isoleren DNA van 200 mL voor bacteriële cultuur door de alkalische lysis methode met behulp van anion-wisselingskolommen volgens de fabrikant protocol (Tabel van materialen). Meng pCAGGS-EGFP en pCAGGS-mCherryNuc op een eindconcentratie van 4 µg/µL elke.Opmerking: Endotoxine-vrije plasmide DNA zuivering kan zijn voorkeur voor electroporation. Incubeer vruch…

Representative Results

Figuur 2 toont de gevisualiseerde oppervlakkige tangentiële migratie in een flat-mount cultuur op een verstreken tijd (0, 9, 18, 27 h) na begin van opname. Film 1 is een time-lapse film van 10 min-intervallen over een periode van 28 uur en 50 minuten. Het frame is geselecteerd om zich te concentreren op de migreren cellen uit de label linksonder van het frame aan de labelloze ruimte (figuur 3A)….

Discussion

Het protocol dat hierboven beschreven is geoptimaliseerd voor het opsporen van cel migratie in de oppervlakkige lagen6,8. Het is van toepassing voor het opsporen van middenlaag migratie streams (film 5)6,7, gewoon door een verschuiving van de timing van de electroporation (E5.5 naar E4.5) en het begin van de cultuur en imaging (E7.0 naar E6.0).

<p class="jove_content…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant nummer 15K 06740 aan Y.W.

Materials

Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF MACHEREY-NAGEL 740422.5 endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe TERUMO SS-20ESZ
18 gauge needle TERUMO NN-1838R
Fast Green Wako 061-00031
100x penicillin and streptomycin Gibco 15140-122
glass capillary tube Narishige G-1
cell culture insert Millipore Millicell CM-ORG
Laminin SIGMA L2020 coating of culture insert
poly-L-Lysine Peptide Institute 3075 coating of culture insert
glass bottom dish Matsunami D11130H
Opti-MEM Gibco 31985-070 culture medium
F12 Gibco 11765-054 culture medium
fetal bovine serum Gibco 12483 culture medium
chick serum Gibco 16110082 culture medium
10xHBSS Gibco 14065-056
microsurgical knife Surgical specialties cooperation 72-1501
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
curved scissors AS ONE No.11
micropipette processor SUTTER INSTRUMENT P97/IVF
forceps-type electrode BEX LF646P3x3
pulse generator BEX CUY21EX electroporator
fluorescence stereoscopic microscope Leica MZ16F
inverted fluorescence microscope Olympus IX81
gas controller Tokken MIGM/OL-2
temperature controller Tokai Hit MI-IBC
laser confocal unit Olympus FV300

References

  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
  4. Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
  5. Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
  6. Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
  7. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
  8. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
  9. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  10. Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).

Play Video

Cite This Article
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum. J. Vis. Exp. (140), e58506, doi:10.3791/58506 (2018).

View Video