التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ
Summary
يصف لنا طرق وضع العلامات الفلورية عرضية ترحيل الخلايا انهانسر، ولتصوير الوقت الفاصل بين حركة خلية مسماة في ثقافة مسطحة-جبل من أجل تصور ترحيل الخلية السلوك في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ .
Abstract
الوقت الفاصل بين التصوير وسيلة قوية لتحليل سلوك الخلية ترحيل. بعد خلية الفلورسنت وسم، يمكن أن تسجل حركة الخلايا المسماة في الثقافة تحت المجهر الفيديو. لتحليل الهجرة الخلية في الدماغ، ثقافة شريحة يستخدم عادة لمراقبة الهجرة الخلية موازية للمقطع شريحة، مثل الهجرة الخلية شعاعي. ومع ذلك، يمكن الحصول على معلومات محدودة من أسلوب ثقافة شريحة لتحليل الهجرة الخلية عمودي إلى قسم الشريحة، مثل الهجرة الخلية عرضية. نقدم هنا، البروتوكولات للوقت الفاصل بين التصوير لتصور الهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ. مزيج من وسم الخلية انهانسر في ovo وثقافة مسطحة-جبل لاحقة على إدراج الثقافة الخلية تمكن من كشف ترحيل حركة الخلية في الطائرة الأفقي. وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب يسهل الكشف عن سلوك الخلية الفردية والعمل الجماعي لمجموعة من الخلايا على المدى الطويل. يمكن تطبيق هذا الأسلوب يحتمل أن تكون للكشف عن تغيير متسلسلة المسمى فلوري-البنية الصغرى، بما في ذلك استطالة محواري في تشريد الأنسجة أو الخلايا العصبية في الأنسجة غير العصبية.
Introduction
دراسة الهجرة الخلية تحرز تقدما مع تقدم تقنية التصوير الحي. بعد خلية الفلورسنت وسم، يمكن أن تسجل حركة الزمانية للخلايا المسماة في صحن الثقافة أو في فيفو تحت المجهر الفيديو. في دراسة التنمية العصبية، تم تحليل التغيرات المورفولوجية لترحيل الخلايا أو التمطيط محاور عصبية استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. للتصوير بفعالية، من الضروري لتطبيق أسلوب مناسب لإعداد وضع العلامات وأنسجة الخلية الفلورسنت، استناداً إلى الغرض من التجربة والتحليل. لتحليل الهجرة الخلية في الدماغ، ثقافة شريحة تستخدم عادة لمراقبة الهجرة الخلية موازية للمقطع شريحة، مثل خلية شعاعي الهجرة1،،من23. كما يستخدم النظام ثقافة شريحة للكشف عن خلية عرضية الهجرة4،5، ولكن أنها ليست مناسبة لتحليل الاتجاهات في الحالات حيث تفريق الخلايا عمودي إلى المقطع شريحة.
ويتألف من بنية متعددة الطبقات، التي شكلتها الهجرة الخلية شعاعي وعرضية أثناء التطور الجنيني تكتم الألياف البصرية. تشكيل طبقة تيكتال يعتمد أساسا على الهجرة شعاعي من الخلايا السليفة العصبية بوستميتوتيك في منطقة البطين، ووجهتهم النهائية في الطبقات التي ترتبط بتاريخ الولادة في منطقة البطين6. أما بالنسبة للهجرة عرضية، أبلغنا سابقا اثنان تيارات الهجرات في الطبقات المتوسطة وسطحية في تيكتوم بصرية فرخ النامي. في الطبقات المتوسطة خلال E6-E8، تهاجر الخلايا القطبية الثنائية مع عملية طويلة رائدة وعملية زائدة رقيقة دورسالي أو بطنيا على طول فاسسيكولوس إكسون لمحاور عصبية ناقل تيكتال التي يتم تشغيلها دورسو بطنيا7. بعد الهجرة أكسوفيليك، وهذا التفريق بين الخلايا في الخلايا العصبية متعدد الأقطاب الموجودة في الطبقات العميقة. في الطبقات السطحية خلال E7-E14، تفريق الخلايا المهاجرة أفقياً بإصلاح عملية الرائدة تشعبت ومبعثر في عدة اتجاهات8. بعد تفريق الهجرة، تفرق خلايا هذه الأخيرة في نهاية المطاف في الخلايا العصبية سطحية من مورفولوجيس مختلفة. وفي كلتا الحالتين، ثقافة مسطحة-جبل تتسم بالكفاءة لمراقبة حركة الخلية موازيا للسطح بيل.
نقدم هنا، بروتوكولا للوقت الفاصل بين التصوير لتصور الهجرة الخلية عرضية في تكتم الألياف البصرية الفرخ النامي7،8. مزيج من وسم الخلية انهانسر في ovo، وثقافة مسطحة-جبل لاحقة على إدراج الثقافة الخلية تمكن من كشف خلية ترحيل اتجاه حركة التنقل والهجرة. والهدف من هذا الأسلوب تيسير الكشف عن سلوك الخلية الفردية على حد سواء في الأجل الطويل والعمل الجماعي لمجموعة من الخلايا في الطائرة الأفقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول هو موضح أعلاه هو الأمثل للكشف عن الهجرة الخلية في الطبقات السطحية6،8. كان قابلاً للكشف عن الطبقة الوسطى الهجرة تيارات (فيلم 5)6،7، فقط عن طريق تحويل توقيت انهانسر (E5.5 إلى E4.5) وظهور ثقافة والتصوير (E7….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيده عدد المنح كاكينهي JSPS 15 ك 06740 إلى Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
