Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde
Summary
Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .
Abstract
Hızlandırılmış görüntüleme geçirme hücre davranış analiz etmek için güçlü bir yöntemdir. Etiketleme floresan hücre sonra etiketli hücre kültüründe hareket video mikroskobu altında kaydedilir. Gelişmekte olan beyin hücre göç analiz için dilim kültür, hücre göç radyal hücre geçiş gibi dilim bölümüne paralel gözlemlemek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, sınırlı bilgi hücre göç teğet hücre geçiş gibi dilim bölümüne dikey analiz etmek için dilim kültür yönteminden elde edilebilir. Burada, gelişmekte olan piliç optik tectum geçişinde teğet hücre görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme iletişim kurallarını mevcut. Hücre çoğalmasıyla ovo içinde ve bir sonraki düz-mount kültür üzerine hücre kültür yerleştirin etiketleme bir arada yatay düzlemde geçirme hücre hareketinde tespiti sağlar. Ayrıca, bizim Yöntem, tek tek hücre davranış ve bir grup hücreyi toplu eylem uzun vadede kolaylaştırır. Bu yöntem yapının floresan etiketli mikro-aksonal uzama olmayan sinir dokusu sinir doku veya hücre deplasman dahil olmak üzere sıralı değişikliği algılamak için potansiyel olarak uygulanabilir.
Introduction
Hücre göç çalışmanın ilerleyen canlı görüntüleme tekniği ile ilerleme. Etiketleme floresan hücre sonra etiketli hücre kültür çanak veya vivo içinde geçici hareket video mikroskobu altında kaydedilir. Sinirsel gelişim çalışmada, hücreleri geçiş veya aksonlar elongating morfolojik değişiklikleri analiz edilmiştir hızlandırılmış Imaging’i kullanma. Etkin görüntüleme için deney ve analiz amacına bağlı floresan hücre ve doku etiketleme hazırlık için uygun bir yöntem uygulamak esastır. Gelişmekte olan beyin hücre göç analiz için dilim kültür hücre göç gibi radyal hücre geçiş1,2,3dilim bölümüne paralel gözlemlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Dilim kültür sistemi de teğet hücre geçiş4,5algılamak için kullanılır, ama nerede hücreleri dikey dilim bölümüne dağıtmak durumlarda yönlü analiz için uygun değildir.
Optik tectum radyal ve teğet hücre geçiş embriyonik gelişim sırasında oluşturduğu çok katmanlı bir yapı oluşur. Tectal tabaka oluşumu ventrikül bölgeden postmitotic nöronal öncü hücrelerinin radyal geçiş öncelikle bağlıdır ve gidecekleri katmanlarındaki Doğum tarihlerine ventrikül bölge6‘ ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Teğet göç gelince, daha önce iki gelişmekte olan bir piliç optik tectum orta ve yüzeysel katmanlarda geçişlerde streams bildirdi. E6 E8 sırasında Orta katmanlarında dorso-ventrally7çalıştırmak tectal efferent aksonlar axon bulunduğu dorsally veya ventrally kadar önde gelen bir işlemi ve ince sondaki işlemi ile bipolar hücreler göç eder. Bu axophilic geçişten sonra içine derin katmanlarda yer alan multipolar nöron hücreleri ayırt etmek. E7-E14 sırasında yüzeysel katmanlarda geçirme hücreleri yatay dallı önde gelen işlem ve dağılım birden fazla yönde8içine reform tarafından dağıtmak. Geçiş dağıtırken sonra ikinci hücre sonunda çeşitli türleri morfoloji yüzeysel nöronların ayırt etmek. Her iki durumda da, bir düz-mount kültür hücre hareketi pial yüzeyine paralel gözlemlemek için etkilidir.
Burada, teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik tectum7,8görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Hücre çoğalmasıyla ovo içindeve bir sonraki düz-mount kültür üzerine hücre kültür yerleştirin etiketleme birlikte geçirme hücre hareketi ve geçiş yönünü tespiti sağlar. Bu yöntem, uzun vadeli ve bir grup hücreyi yatay düzlemde toplu eylem her iki tek hücre davranış algılama kolaylaştırmak için hedeftir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklanan protokol yüzeysel katmanları6,8‘ hücre göç algılamak için optimize edilmiştir. Sadece değişen Elektroporasyon (E4.5 E5.5) zamanlaması ve kültür başlangıcı ve (E6.0 E7.0) görüntüleme tarafından orta tabaka göç akışları (film 5)6,7, algılamak için geçerlidir.
Sunulan yordamı etiketleme Hücre ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser JSP’ler KAKENHI Grant numarası tarafından desteklenen 15K 06740 Y.W. için
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
