النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى وصف أسلوب استنساخه للجمع بين فصل البشرية pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية وأستروسيتيس معا في 3D المجال كوكولتوريس، الحفاظ على هذه المجالات في ظروف العائمة مجاناً، وفي وقت لاحق قياس نشاط الدائرة متشابك المجالات إيمونواناليسيس وتسجيلات مولتيليكترودي الصفيف.
Abstract
حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات الصلة لدراسة الدماغ البشري. التكنولوجيا الناشئة واحد للتصدي لهذه المشكلة هو استخدام الأبعاد (3D) الخلايا العصبية الثقافات الثلاث، ووصف ‘أورجانويدس’ أو ‘الماغنيسيوم’، للحفاظ على المدى الطويل للتفاعلات بين الخلايا، بما في ذلك جزيئات الالتصاق خارج الخلية. ومع ذلك، هذه الأنظمة الثقافة مضيعة للوقت ولا يتم إنشاؤه بشكل منهجي. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سرعة واستمرار إنتاج 3D كوكولتوريس من الخلايا العصبية وأستروسيتيس من البشر pluripotent الخلايا الجذعية. فصل astrocytes أولاً، قبل متمايزة وفروعه الخلايا العصبية وتحسب. بعد ذلك، يتم دمج الخلايا في مجال تشكيل الأطباق مع مثبط رو-كيناز وفي نسب معينة لإنتاج مجالات حجم استنساخه. بعد عدة أسابيع من الثقافة كمجالات عائمة، وأخيراً كوكولتوريس (الكويكبات) مقطوع ل immunostaining أو مطلي على صفائف مولتيليكترودي لقياس كثافة متشابك وقوتها. وبصفة عامة، فمن المتوقع أن هذا البروتوكول سوف تسفر عن المجالات العصبية 3D عرض علامات نوع الخلية الناضجة مقيدة، وتشكل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية ومعرض نشاط الشبكة متشابك عفوية الاندفاع. معا، يسمح هذا النظام فحص المخدرات والتحقيقات في آليات للمرض في نموذج أكثر ملاءمة بالمقارنة مع ثقافات أحادي الطبقة.
Introduction
أستروسيتيس نوع خلية الدبقية عالية وفيرة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع مجموعة متنوعة من المسؤوليات الوظيفية خارج نطاق الدعم الهيكلي. من خلال إفراز العوامل سينابتوجينيك للذوبان ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، المعونة astrocytes في إنشاء وتجميع نهايات ناضجة خلال التنمية1. كما تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على الصحة واللدونه من الاشتباكات العصبية إلى خارج الخلية إشارات2،3،،من45، والإسهام في تحقيق الاستقرار الطويل الأجل من التماثل الساكن البيئات التي تنظم البوتاسيوم خارج الخلية وغلوتامات، فضلا عن إفراز ركائز الطاقة و ATP6،،من78. وأخيراً، يمكن أن تسهم إسهاما كبيرة بالتأثير على تيارات اكستراسينابتيك9، وغير مباشر يمكن أن تؤثر في النشاط من خلال أنواع الخلايا الأخرى مثل تعزيز مييلينيشن10. الأهم من ذلك، لأنه شذوذ أو خلل وظيفي من أستروسيتيس يمكن أن يؤدي إلى العديد من المتلازمات النمائية العصبية وأمراض الأعصاب الكبار، هناك حاجة واضحة لتشمل astrocytes جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية داخل هندسة الشبكات العصبية من أجل تحسين نموذج للبيئة الدماغ الذاتية. سمة لا يتجزأ من أستروسيتيس هو قدرتهم على النموذج التفاعلات الدينامية مع نهايات الخلايا العصبية1،،من1112. في حالة عدم إطلاق، تشكل الخلايا العصبية لعدد محدود من نقاط الاشتباك العصبي، بصورة عامة كما تفتقر إلى النضج الوظيفي13.
Astrocytes البشرية عرض الخصائص المورفولوجية والنسخي والوظيفية – مثل الزيادة في حجم وتعقيد الجينات التفريع، فضلا عن إبلاغها – التي لا يرد موجز لها في القوارض12،14، 15. ونتيجة دراسات استخدام الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسك)-مشتقة من الخلايا العصبية وقد تصبح مقبولة على نطاق واسع كوسيلة لدراسة الأمراض المتصلة بالجهاز العصبي المركزي في المختبر أثناء تطوير علاجات جديدة ونماذج الضرر ونماذج الثقافة16 ،17. وعلاوة على ذلك، تسمح هبسكس دراسة تشكيل المشبك البشرية ووظيفة دون الحاجة للأنسجة الابتدائية18،19.
حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات صلة من الدماغ البشري. وهناك حاجة إلى منبر مناسب الخص شبكاته متشابك مع الدقة العالية وإمكانية تكرار نتائج. في الآونة الأخيرة، برز اهتمام في إنتاج نظم الثقافة 3D (على نطاق واسع يعرف باسم ‘أورجانويدس’، ‘الماغنيسيوم’، أو ‘ميني العقول’)20 نموذج معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) لهياكل على المستويين الخلوي والكلى. الاحتفاظ الثقافة 3D نظم إدارة المحتوى في المؤسسة وخلية خلية التفاعلات التي تكون عادة غائبة أو محدودة خلال كوكولتوري 2D نموذجية نماذج21،22. توجد وفرة تقنيات استزراع الماغنيسيوم العصبية 3D24،،من2325؛ بيد كثيرة تتطلب فترات طويلة من الثقافة (أشهر إلى سنوات) للتنمية عفوية والحفاظ على طبقة، مع المستخدم نستعرض القليل جداً من التحكم في الإخراج.
هنا، نحن توضيح أسلوب منهجي لسرعة واستمرار التفاعلات العصبية بيونجينير بين أنواع متعددة من الخلايا (الخلايا العصبية قبل متمايزة و astrocytes) مستمدة من هبسكس بتجميع الخلايا في مجال كوكولتوريس (‘الكويكبات’)26 أن الخص التعقيدات الخاصة بالإنسان المورفولوجية في 3D. يولد هذا الجهاز العصبي عالي الكثافة موزعة بالتساوي المخططات العصبية التي تأخذ على خصائص ناضجة مع مرور الوقت ويمكن فحص أو جزيئي في طريقة الفائق. علينا أن نظهر للمرة الأولى أن أستروسيتيس البشرية الحث على نشاط الشبكة متشابك الاندفاع في هذه كوكولتوريس ثلاثي الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، أن هذا البروتوكول لا يمكن تكييفها بسهولة لإنشاء مجالات ذات أحجام مختلفة، الاستفادة من الخلايا المحددة لمختلف الهويات الإقليمية من الجهاز العصبي المركزي، ودراسة التفاعلات بين العديد من أنواع الخلايا الأخرى كما هو مطلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، يمكننا وصف أسلوب منهجي لإنتاج 3D مجالات كوكولتوريس العصبية. المجالات تتألف من أستروسيتيس، والخلايا العصبية، مستمدة بشكل مستقل من هبسكس. على الرغم من عدم تركيز هذا البروتوكول، توليد نقية السكان astrocytes من هبسكس28 خطوة بالغة الأهمية ويمكن أن يكون تحديا تقنيا إذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور إريك أليان (UCSF) للمدخلات الفكرية في تصميم هذه الإجراءات، الدكتور مايكل وارد (المعاهد الوطنية للصحة) للمشورة التقنية بشأن المفاضلة إينيورون، و “سابا برلاس” لتحليل الصورة الأولية.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
References
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
- Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
- Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
- Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
- Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
- Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
- Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
- Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
- Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
- Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
- Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
- Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
- Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
- Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
- Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
- Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
- Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
- Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
- Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).
