Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell’attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.
Abstract
Una barriera alla nostra comprensione di come i vari tipi di cellule e segnali contribuiscono alla funzione sinaptica circuito è la mancanza di modelli pertinenti per lo studio del cervello umano. Una tecnologia emergente per affrontare questo problema è l’uso di tre dimensionale culture di cellule neurali (3D), definito ‘organoids’ o ‘sferoidi’, per la conservazione a lungo termine delle interazioni intercellulari tra molecole di adesione extracellulare. Tuttavia, questi sistemi di coltura sono che richiede tempo e non sistematicamente generato. Qui, abbiamo dettaglio un metodo per rapidamente e costantemente produrre 3D cocultures di neuroni e astrociti da pluripotenti umane cellule staminali. In primo luogo, pre-differenziati astrociti e progenitori neurali sono dissociati e conteggiati. Successivamente, le cellule sono combinate nella formazione di sfera piatti con un inibitore della Rho-chinasi e a rapporti specifici per produrre sfere di dimensioni riproducibili. Dopo diverse settimane di cultura come sfere galleggianti, cocultures (‘asteroidi’) sono infine cimentarsi per immunostaining o placcato su matrici multielettrodo per misurare la forza e la densità sinaptica. In generale, si prevede che questo protocollo produrrà sfere 3D neurale che visualizzare i marcatori di cellula-tipo maturo limitato, formano delle sinapsi funzionali e presentano attività di rete sinaptica spontanea di scoppio. Insieme, questo sistema permette lo screening di stupefacenti e le indagini sui meccanismi della malattia in un modello più adatto rispetto a colture dello strato monomolecolare.
Introduction
Gli astrociti sono un tipo molto abbondante delle cellule glial all’interno del sistema nervoso centrale (SNC) con una varietà di responsabilità funzionali di là di sostegno strutturale. Attraverso la secrezione di fattori solubili synaptogenic e componenti della matrice extracellulare (ECM), astrociti aiutano di clustering delle sinapsi mature durante sviluppo1e l’istituzione. Anche giocano un ruolo critico nel mantenimento della salute e la plasticità delle sinapsi attraverso segnalazione extracellulare2,3,4,5e contribuire alla stabilità a lungo termine di omeostatico ambienti regolando la concentrazione extracellulare del potassio e del glutammato, come pure la secrezione di substrati energetici e ATP6,7,8. Infine, essi possono contribuire alla neurotrasmissione influenzando le correnti extrasynaptic9e indirettamente possono influenzare l’attività attraverso altri tipi di cellule come la promozione della mielinizzazione10. Cosa importante, perché l’anomalia o disfunzione dei astrocytes può portare a molte sindromi dello sviluppo neurologico e neuropatologia adulto, c’è un’evidente necessità di includere astrociti a fianco di neuroni all’interno di reti neurali ingegnerizzati in ordine per una migliore modello dell’ambiente endogeno del cervello. Una caratteristica integrante degli astrociti è la loro capacità di interazioni dinamiche di forma con le sinapsi neuronali1,11,12. In assenza della glia, i neuroni formano un numero limitato di sinapsi, che in generale anche la mancanza di maturità funzionale13.
Gli astrociti umani visualizzano caratteristiche morfologiche, trascrizionale e funzionale — come aumento delle dimensioni e della complessità di ramificazione, così come specie-specifici geni — che non sono si ricapitola in roditori12,14, 15. Di conseguenza, gli studi che utilizzano cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule neurali derivate hanno diventare ampiamente accettate come mezzo di esaminare malattie CNS-relative in vitro durante lo sviluppo di nuove terapie, lesioni modelli e paradigmi della cultura16 ,17. Inoltre, hPSCs consente lo studio della formazione della sinapsi umana e funzione senza l’esigenza primaria del tessuto18,19.
Una barriera alla nostra comprensione di come i vari tipi di cellule e segnali contribuiscono alla funzione sinaptica circuito è la mancanza di modelli pertinenti del cervello umano. C’è bisogno di una piattaforma adeguata di ricapitolare le sue reti sinaptiche con alta fedeltà e riproducibilità. Recentemente, l’interesse è emerso nella produzione di sistemi di coltura 3D (largamente conosciuto come ‘organoids’, ‘sferoidi’, o ‘mini cervelli’)20 per modellare complessi tridimensionali (3D) strutture a livello cellulare e macro. Sistemi di coltura 3D mantengono interazioni ECM e cellula-cellula che sono normalmente assente o limitata durante coculture 2D tipici paradigmi21,22. Esiste una grande varietà di tecniche per la coltura di sferoidi neurale 3D23,24,25; Tuttavia, molti richiedono cultura lunghi periodi (mesi-anni) per sviluppo spontaneo e la conservazione di strato, con l’utente che esibiscono molto poco controllo sull’output.
Qui, vi illustriamo un metodo sistematico per rapidamente e costantemente bioingegnere neurale interazioni tra più tipi di cellule (neuroni pre-differenziati e astrociti) derivato da hPSCs assemblando cellule in cocultures sfera (asteroidi)26 che ricapitolano umane specifiche complessità morfologica in 3D. Questo sistema ad alta densità neuronale genera sottotipi neurali uniformemente dispersi che assumere proprietà matura nel tempo e possono essere schermati o analizzati in un modo ad alta velocità. Dimostriamo per la prima volta che gli astrociti umani inducono attività di burst di rete sinaptica in questi cocultures 3D. Inoltre, questo protocollo è facilmente adattabile per generare sfere di diverse dimensioni, di utilizzare celle specificate per diverse identità regionali del SNC e per studiare le interazioni di più altri tipi di cellulari come desiderato.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo un metodo sistematico per la produzione di sfere 3D di cocultures neurale. Le sfere sono composti da astrociti e neuroni, che sono derivati in modo indipendente da hPSCs. Anche se non il fuoco di questo protocollo, la generazione delle popolazioni puri dei astrocytes da hPSCs28 è un passo fondamentale e può essere tecnicamente impegnativa se eseguita senza precedente esperienza. Questo primo passo per la generazione di questi microcircuiti sinaptici deve essere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Dr. Erik Ulliano (UCSF) per l’input intellettuale la progettazione di queste procedure, Dr. Michael Ward (NIH) consulenza tecnica sulla differenziazione Tatal e Saba Barlas per analisi preliminare delle immagini.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
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