Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen
Summary
In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.
Abstract
Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen für das Studium des menschlichen Gehirns. Eine neue Technologie zur Behebung dieses Problems ist die Verwendung von drei dreidimensionale (3D) neuronalen Zellkulturen, “Organellen” oder “Sphäroide”, für die dauerhafte Erhaltung der interzelluläre Wechselwirkungen einschließlich extrazellulärer Adhäsionsmoleküle bezeichnet. Diese Systeme sind jedoch zeitaufwendig und nicht systematisch erzeugt. Hier wir ausführlich eine Methode, um schnell und konsequent produzieren 3D Kokulturen von Neuronen und Astrozyten aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Erste, bereits differenzierte Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen sind getrennt gezählt. Als nächstes werden Zellen im Bereich Bildung kombiniert Gerichte mit einem Rho-Kinase-Inhibitor und in bestimmten Verhältnissen Sphären reproduzierbare Größe produzieren. Nach mehreren Wochen der Kultur als schwimmende Kugeln sind Kokulturen (“Asteroiden”) schließlich für Immunostaining geschnitten oder überzogen auf multielectrode Arrays, synaptische Dichte und Stärke zu messen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass dieses Protokoll neuronale 3D-Kugeln, die anzeigen Reife Zelltyp eingeschränkt Marker erzielt werden, funktionale Synapsen bilden und zeigen spontane synaptischen Netzwerkaktivität platzen. Dieses System ermöglicht zusammen, Drogen-Screening und Untersuchungen zu Mechanismen der Krankheit in einem geeigneteren Modell im Vergleich zu Monolayer-Kulturen.
Introduction
Astrozyten sind ein sehr reichlich glialen Zelltyp innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) mit einer Vielzahl von funktionalen Aufgaben über strukturelle Unterstützung. Astrozyten Beihilfen durch Sekretion von löslichen Synaptogenic Faktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) bei der Schaffung und Bündelung von Reifen Synapsen während Entwicklung1. Sie auch spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und der Plastizität der Synapsen durch extrazelluläre Signal2,3,4,5, und tragen zur langfristigen Stabilität der homöostatischen Umgebungen durch Regulierung der extrazellulären Kalium sowie Glutamat und die Sekretion von Energie-Substrate und ATP6,7,8. Endlich, sie können dazu beitragen, Neurotransmission durch Beeinflussung der extrasynaptic Ströme9, und Aktivität durch andere Zelltypen wie die Förderung der Myelinisierung10indirekt beeinflussen können. Wichtig ist, weil zu viele Neurodevelopmental Syndrome und Erwachsenen Neuropathologie Anomalie oder Dysfunktion der Astrozyten führen kann, gibt es offensichtlich notwendig, damit eine verbesserte Astrozyten neben Neuronen innerhalb veränderter neuronaler Netze enthalten Modell der endogenen Gehirn Umwelt. Ein integraler Bestandteil Astrozyten ist ihre Fähigkeit, Form dynamischer Interaktion mit neuronalen Synapsen1,11,12. In Ermangelung der Glia bilden Neuronen eine begrenzte Anzahl von Synapsen, die in der Regel auch funktionale Reife13 fehlt.
Menschliche Astrozyten morphologischen, transkriptionelle und funktionellen Merkmale darstellen – wie zunehmende Größe und Komplexität der Verzweigung sowie artspezifische Gene –, sind nicht in Nagetieren12,14, rekapitulierte 15. Infolgedessen Studien unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete neuronalen Zellen werden akzeptiert als ein Mittel der CNS-Erkrankungen in-vitro- Prüfung, bei der Entwicklung neuartiger Therapien, Verletzungen Modelle und Kultur Paradigmen16 ,17. Darüber hinaus ermöglichen hPSCs die Studie der menschlichen Synapse Entstehung und Funktion ohne die Notwendigkeit für primäre Gewebe18,19.
Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen des menschlichen Gehirns. Besteht ein Bedarf für eine geeignete Plattform zu ihrer synaptischen Netzwerke mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu rekapitulieren. Vor kurzem, hat Interesse in der Produktion von 3D Culture Systeme entstanden (allgemein bekannt als “Organellen,” “Sphäroide” oder “Mini-Köpfe”)20 bis komplexe dreidimensionale (3D) Modell Strukturen auf der zellulären und Makroebene. 3D Culture-Systeme behalten ECM und Zell-Zell-Interaktionen, die normalerweise nicht vorhanden oder nur während der typischen 2D Coculture Paradigmen21,22. Eine Fülle von Techniken existieren für die Kultivierung 3D neuronale Sphäroide23,24,25; jedoch erfordern viele langwierige Kultur Zeiträume (Monate bis Jahre) für spontane Entwicklung und Erhaltung der Layer, mit dem Benutzer präsentiert sehr wenig Kontrolle über den Ausgang.
Hier zeigen wir eine systematische Methode, um schnell und konsequent Biotechnologe neuronalen Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen (Pre-differenzierten Neuronen und Astrozyten) abgeleitet von hPSCs durch den Zusammenbau von Zellen in Bereich Kokulturen (“Asteroiden”)26 rekapitulieren, die Mensch-spezifische morphologische Komplexität in 3D. Dieses High-Density neuronalen System erzeugt gleichmäßig verteilten neuronalen Untertypen, die übernehmen ältere Eigenschaften im Laufe der Zeit und können gezeigt oder in gewissem Sinne Hochdurchsatz-untersucht. Wir zeigen erstmals, dass menschliche Astrozyten synaptischen Netzwerkaktivität platzen in dieser 3D Kokulturen induzieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll leicht anpassbar, Kugeln in verschiedenen Größen, um Zellen angegeben, um unterschiedlichen regionalen Identitäten des ZNS zu nutzen und Interaktionen von mehreren anderen Zelltypen wie gewünscht zu studieren zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine systematische Methode zur Herstellung von 3D-Kugeln neuronale Kokulturen. Die Kugeln bestehen aus Astrozyten und Neuronen, die unabhängig von hPSCs abgeleitet werden. Obwohl nicht der Schwerpunkt dieses Protokolls, die Erzeugung von reinen Populationen von Astrozyten aus hPSCs28 ist ein entscheidender Schritt und technisch anspruchsvoll, wenn ohne Vorkenntnisse durchgeführt werden kann. Dieser erste Schritt bei der Erzeugung von diesen synaptischen Mikros…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Dr. Erik Ullian (UCSF) für geistigen Beitrag auf die Gestaltung dieser Verfahren, Dr. Michael Ward (NIH) für technische Beratung bezüglich iNeuron Differenzierung und Saba Barlas für vorläufige Bildanalyse.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
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