JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Abstract

İnsan beyni çalışmak için ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Bu soruna yönelik bir gelişen teknoloji ‘organoids’ veya ‘pulcuklarının’, hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere hücre adezyon molekülleri uzun vadeli korunması için ifade edilen üç boyutlu (3D) sinir hücre kültürleri, kullanmaktır. Ancak, bu kültür zaman alıcı ve sistematik olarak oluşturulan sistemlerdir. Burada, biz hızla ve sürekli nöronların 3D cocultures üretmek için bir yöntem detay ve astrocytes gelen insan pluripotent kök hücre. İlk, önceden farklılaşmış astrocytes ve nöronal ataları ayrışmış ve sayılır. Küre-oluşturan hücreler daha sonra birleştirilir yemekleri ile bir Rho-kinaz inhibitörü ve küreler tekrarlanabilir boyutta üretmek için belirli oranları. Kültür kayan küreler olarak birkaç hafta sonra cocultures (‘asteroitler’) son olarak immunostaining için kesitli veya sinaptik yoğunluğu ve gücü ölçmek için multielectrode diziler kaplama. Genel olarak, bu protokol olgun hücre türü kısıtlanmış işaretleyicileri görüntülemek, fonksiyonel sinapslarda formu ve spontan sinaptik ağ veri bloğu aktivite sergilemek 3D sinirsel küreler verecektir bekleniyor. Birlikte, bu sistem uyuşturucu tarama ve mekanizmaları soruşturmalar hastalığının monolayer kültürlere göre daha uygun bir model izin verir.

Introduction

Astrocytes pek çok yapısal destek ötesinde fonksiyonel sorumlulukları ile merkezi sinir sistemi (MSS) içinde son derece bol gliyal hücre tipi vardır. Salgılanması çözünür synaptogenic faktörler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinin kurulması ve geliştirme1sırasında olgun sinapslarda kümeleme astrocytes yardım. Ayrıca sağlık ve plastisite sinapslarda ile hücre dışı sinyal2,3,4,5kritik bir rol oynamaktadır ve homeostatik için uzun vadeli istikrar katkıda hücre dışı potasyum ve glutamat yanı sıra enerji yüzeylerde ve ATP6,7,8salgılanmasını düzenleyerek ortamlar. Son olarak, onlar için neurotransmission extrasynaptic akımları9etkileyen tarafından katkıda bulunabilir ve etkinlik myelination10teşvik gibi diğer hücre türleri aracılığıyla dolaylı olarak etkileyebilir. Önemlisi, anormallik veya astrocytes disfonksiyon birçok nörogelişimsel sendromları ve yetişkin nevropatoloji yol açabilir çünkü sırayla için geliştirilmiş bir astrocytes nöronlar mühendislik sinir ağları içinde yanında dahil etmek için bir açık gerek yoktur endojen beyin çevre modeli. Astrocytes ayrılmaz bir özelliği ile nöronal sinapslarda1,11,12formu dinamik etkileşimler için onların yeteneğidir. Glia yokluğunda, genel de fonksiyonel olgunluk13eksikliği sinapslarda sınırlı sayıda neurons oluşturur.

İnsan astrocytes, transkripsiyon, morfolojik ve fonksiyonel özellikleri görüntülemek — artan büyüklüğü ve karmaşıklığı dallanma, hem de species-specific gen gibi — kemirgenler12,14‘, değil recapitulated 15. Sonuç olarak, çalışmalar insan pluripotent kök hücre (hPSC) kullanan-türetilmiş sinir hücreleri haline yaygın olarak kabul yeni tedaviler, yaralanma modelleri ve kültür paradigmalar16 geliştirirken CNS bağlı hastalıklar vitro incelenmesi aracı olarak ,17. Ayrıca, hPSCs insan synapse oluşumu ve işlev birincil doku18,19gerek kalmadan çalışma izni.

İnsan beyninin ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Yüksek sadakat ve tekrarlanabilirlik ile onun sinaptik ağları özetlemek uygun bir platform için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, faiz 3D kültür sistemleri üretiminde ortaya çıkmıştır (genel olarak ‘organoids’ bilinen ‘pulcuklarının’ veya ‘mini beyin’) karmaşık üç boyutlu (3D) modelleme20 yapıları cep ve makro düzeyde. 3D kültür sistemleri tipik 2D coculture paradigmalar21,22sırasında normalde bulunmadığından veya sınırlı ECM ve hücre-hücre etkileşimleri korur. Teknikleri bir bolluk var 3D sinirsel pulcuklarının23,24,25kültür için; Ancak, birçok uzun kültür dönemleri gerektirir (ay-yıl) spontan gelişimi ve katman korunması için Kullanıcı ile çok az çıktı üzerinde denetime sergilenmesi.

Burada, biz hızlı bir şekilde sistematik bir yönteme göstermek ve sürekli genetiğinin sinirsel etkileşim arasında birden çok hücre tipleri (önceden farklı nöronlar ve astrocytes) hPSCs küre cocultures (‘asteroitler’)26 hücreleri birleştirerek elde edilen 3D insan özgü morfolojik karmaşıklığı özetlemek. Bu yüksek yoğunluklu sinir sistemi zamanla olgun özellikleri almak ve ekranlı veya bir yüksek-den geçerek şekilde denetlesinler eşit dağınık sinirsel alt türlerini oluşturur. Biz insan astrocytes sinaptik ağ veri bloğu etkinliğinde bu 3D cocultures neden ilk kez göstermek. Ayrıca, bu iletişim kuralını küreler farklı boyutlarda, farklı bölgesel MSS kimliklere belirtilen hücreleri kullanmak ve istediğiniz gibi birden çok hücre tiplerinin etkileşimleri çalışmaya oluşturmak için kolayca uyarlanabilir.

Protocol

1. hücre kültür ve reaktif hazırlık Not: Bu bölümde Protokoller’de farklılaşma Protokolü (Bölüm 2) göründükleri sırayla yazılır. Malzeme ve Katalog numaraları Tablo reçetesi görmek. Kaplamalı plakalar hücre kültürü için hazırlayın. Hücre dışı matriks (ECM) kaplama çözüm 1 mg/mL stok çözüm hazırlamak için DMEM/F12 medya ile sulandırmak. Aliquot seyreltilmiş ECM çözümü 3 mL 30 konik tüpler içi…

Representative Results

Düzgün gerçekleştirildiğinde bu protokolü hPSCs (Şekil 1A-1C), oluşturulan astrocytes28,33,34 ve neurons35 işlevsel cocultures tanımlanmış nüfus olarak üretecek daha önce26 detaylı ve burada açıklanan adımları 2.1-2.2. Microwell levha, kullanımı ile kademeli bu yordamı tutarlı bo…

Discussion

Bu protokol için sinirsel cocultures 3D küre imalatı için sistematik bir yöntem açıklanmaktadır. Küre astrocytes ve bağımsız olarak hPSCs elde edilen neurons oluşur. Odağı değil bu protokol rağmen saf astrocytes hPSCs28 üzerinden olasılığını nesil kritik bir adımdır ve deneyiminiz gerçekleştirdiyseniz Teknik olarak zor olabilir. Bu ilk adım bu sinaptik Mikri şemalar nesil titiz zamanlama ve detaylara dikkat ile yapılmalıdır. HPSC elde edilen astrocytes kullanımı u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Erik Ullianlıların (UCSF) tasarımı iNeuron farklılaşması üzerine teknik danışmanlık için Dr Michael Ward (NIH) ve Saba Barlas ön görüntü analizi için bu yordamları, entelektüel girişi için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Synaptic Microcircuit3D CoculturesAstrocytesNeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Cell TypesSynaptic Circuit FormationNeuroscienceOrganoid TechnologiesDrug DevelopmentNeuroregenerationNeural ProgenitorsAstrocyte ProgenitorsAstrocyte SubtypesNeural InductionNeural MediumRho-kinase InhibitorECM-coated PlatesCell AggregationCell DissociationCell Identity ConfirmationCryo-preservation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image