Summary

Isolando e incorporando luz-colheita antenas de diatomáceas Cyclotella Meneghiniana em lipossomas com lipídios tilacoides

Published: August 28, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a fucoxantina clorofila a/c proteínas obrigatórias (FCP) de diatomáceas e incorporá-las em lipossomas com composições de lipídios naturais para estudar a transferência de energia de excitação sobre as alterações de composição do íon.

Abstract

O desempenho fotossintético de plantas, algas e diatomáceas depende fortemente do Regulamento rápido e eficiente, a colheita de luz e energia processos de transferência na membrana tilacoides de cloroplastos. A luz da colheita antena de diatomáceas, as proteínas de ligação a/c de clorofila do chamado fucoxantina (FCP), são necessários para a absorção de luz e centros de transferência eficiente para a reação fotossintética também quanto a foto-proteção contra luz em excesso. O interruptor entre essas duas funções é uma questão de longa data de pesquisa. Muitos desses estudos tenham sido realizados com FCP em micelas de detergente. Para estudos de interacção, os detergentes foram removidos, o que levou a uma agregação inespecífica de complexos do FCP. Nesta abordagem, é difícil discriminar entre artefatos e dados fisiologicamente relevantes. Portanto, informações mais valiosas sobre FCP e outro luz de membrana acoplada colheita complexos podem ser obtidas através do estudo de interações da proteína-proteína, transferência de energia e outros recursos espectroscópicos se estão inseridos em seu ambiente nativo de lipídios. A principal vantagem é que os lipossomas têm um tamanho definido e uma proporção de lipídio/proteína definidos pelo qual a extensão do FCP cluster é controlada. Além disso, alterações na composição do pH e íon que regulam a luz colheita na vivo podem ser facilmente simuladas. Em comparação com a membrana dos tilacoides, os lipossomas são mais homogêneo e menos complexo, que torna mais fácil de obter e compreender dados espectroscópicos. O protocolo descreve o procedimento de FCP isolamento e purificação, preparação de lipossomas e incorporação do FCP lipossomas com composição lipídica natural. Resulta de uma aplicação típica são dadas e discutidas.

Introduction

Organismos fotossintéticos como diatomáceas devem lidar com a constante mudança de condições de luz e responder com mecanismos sofisticados de aclimatação que sustentar alta eficiência fotossintética e protegem contra danos foto-oxidativo causado pela luz excessiva. Um processo de luz-protetores principal em eucariontes fotossintéticos é a alta energia têmpera (qE) da luz absorvida que ocorre como a principal contribuição para a não-fotoquímica têmpera (NPQ) sob condições de estresse leve1,2 ,3. Os complexos de antena colheita luz (LHC) estão envolvidos na regulação das vias de transferência de energia de excitação. Em resposta à luz alta induzidas pelo baixo pH no lúmen do cloroplasto, os interruptores do sistema de antena da luz colheita de estado para o estado de têmpera. Este estado de energia dissipativas protege fotossistemas (PS) e outros complexos na membrana tilacoides de foto-oxidação. Em eucariontes fotossintéticos, o qE é geralmente induzida por dois fatores1,2,3. Um fator é a luz especializada colheita proteína que responde ao baixo pH. A proteína PsbS induz o qE , em maior de plantas4. LhcSRs5, modulada pela atividade do PsbS, induzir o qE nas algas verdes6. Diatomáceas possuem proteínas, como Lhcx que estruturalmente relacionada com a LHCSRs7,8,9,10.

O segundo fator de qE é o ciclo da xantofila onde carotenoides da antena são convertidos em uma forma de foto-protetora por de epoxidação e revertidos por epoxidação. Plantas e algas verdes, violaxantina é convertida em zeaxantina. Diatomáceas, diadinoxantina é convertida em diatoxanthin, que em seguida se correlaciona com a extensão da NPQ11. A luz de diatomáceas colheita antena possui algumas peculiaridades, embora relacionadas com plantas e algas LHCs é evolutiva. O interruptor de luz da colheita para foto-proteção é extremamente rápido e a capacidade NPQ é superior em comparação com plantas12. Isto pode ser uma razão porque diatomáceas são muito bem sucedidas em diferentes nichos ecológicos, de forma que eles são responsáveis por até 45% da produção primária líquida oceânica13. Portanto, luz, sistemas de colheita de diatomáceas são um interessante objeto de pesquisa de fotossíntese.

Diatomáceas, como as espécies centralizado no Cyclotella meneghiniana, possuem tilacoides intrínseca luz colheita sistemas em homenagem os pigmentos eles vincular – fucoxantina, clorofila (chl) a e c, daí Light FCP. colheita de proteínas, tais como FCPs, são incorporado no sistema de membrana tilacoides, composto por várias camadas de membrana. Diatomáceas formam bandas de três contém. Este complexo situação dificulta a estudá-los no nível molecular na membrana tilacoides. Além disso, muitos componentes contribuem para a regulação da luz da colheita (veja acima). Portanto, em muitas abordagens, os complexos foram isolados a partir da membrana usando detergentes suaves, tais como n-dodecil-β-D-maltopyranoside (β-DDM), que solubilizar a membrana, mas manter os complexos FCP intacta. Muitos estudos espectroscópicos foram realizados usando o FCP solubilizado para investigar a energia intramolecular transferência14,15,16,17. No entanto, esta primeira abordagem foi limitada, desde que o Regulamento de transferência de energia precisa de excitônicas interação com outros complexos de antena ou de fotossistemas. Daí, esses tipos de estudos não podem ser realizados com solubilizado complexos porque a interação entre complexos é perdida.

Uma característica importante no Regulamento da antena é a “exclusão molecular” da antena e fotossistemas na membrana tilacoides18. Anteriormente, realizou uma abordagem simples para simular este efeito in vitro. O detergente foi removido, o que leva à agregação aleatória de complexos de antena. Embora alguns dados razoáveis foi obtidos por esta abordagem17,19, a remoção do detergente não reflete a situação na vivo e tem algumas limitações, desde que os complexos não estão interagindo em sua regular terciário estrutura.

O uso de lipossomas supera várias das limitações anteriores. A estrutura terciária ainda está totalmente intacta. A membrana do lipossoma fornece um ambiente quase nativo para os complexos de antena. A membrana separa o interior do lipossoma o ambiente exterior. Por estes meios, os lipossomas fornecem dois compartimentos de reação para estudos de gradientes iônica e pH, bem como quanto aos processos de transporte. Além disso, os parâmetros do sistema experimental podem ser controlados mais facilmente para estudos na membrana tilacoides. Os lipossomas foram já mostrou ser uma excelente ferramenta para o estudo de complexos fotossintéticos. Um grande foco no passado foi na planta LHC onde o efeito de composição de lipídios alterados foi testado no LHC II20. Em outras abordagens, a interação da proteína-proteína entre diferentes LHC II foram investigados21. Além disso, alguns em algas verdes foram realizados estudos que descrevem a aglomeração espontânea entre LHC22. Considerando a importância das diatomáceas para ecossistemas aquáticos, relativamente poucos estudos foram realizados com complexos de antena de diatomáceas. Dois estudos investigaram os complexos antena do centralizado no meneghiniana de Cyclotella, onde a aglomeração do FCP antena23 e capacidade de resposta do FCP para gradientes eletroquímicos24 foram mostrados. Assim, os lipossomas são uma excelente ferramenta para estudar a antenas de diatomáceas e sua interação e regulamento em condições quase nativos. Os lipossomas são versáteis desde muitas condições tais como a composição de lipídios, lipossomas tamanho, densidade de proteína e a fase aquosa circundante pode ser controlada. Além disso, o método requer pequenas quantidades de amostras. O sistema experimental é robusto e altamente reprodutíveis. Compartimentação dos lipossomas permite estudar o pH e gradientes de íons, que são importantes fatores na regulação dos complexos de antena.

Aqui, descrevemos o isolamento de complexos de antena FCP de c. meneghiniana e sua incorporação em lipossomas com composição lipídica de tilacoides natural. Também, fornecemos dados exemplares para a caracterização espectroscópica de FCP solubilizado e compará-los com FCP em lipossomas. O método resume o conhecimento e protocolos padronizados obtidos com as melhorias de Gundermann e Büchel 201223Natali et al 201622e Ahmad e 2017 Dietzel24.

Figure 1
Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho. (1) refere-se ao n º 1, que descreve o crescimento celular, ruptura e isolamento de tilacoides com a seguinte separação FCP em gradientes de densidade de sacarose; C. m. -Células deCyclotella meneghiniana . (2) preparação de tilacoides natural mistura de lipídios (MGDG, Junior e SQDG) descrita no n º 2 e criação de micelas de lipídios-detergente com octylglycoside (OG). Um tamanho definido lipid-micelle é alcançado por extrusão usando membranas de um diâmetro de poro definido. FCP e micelas de lipídios são unificadas em um lipido predefinido: proporção de proteína e os detergentes OG e β-DDM são removidos através de controlada diálise formando FCP proteoliposomes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Nota: Complexos fotossintéticos como FCPs são altamente vulneráveis à luz e ao calor. Sempre trabalho no gelo e sob uma luz muito fraca. 1. isolamento de FCP de células Isolamento de tilacoides de células de c. meneghiniana C. meneghiniana em cinco frascos de 500 mL que cada um preenchido com 300 mL de ASP-médio23,25 e 50 milhões de células de crescer. Co…

Representative Results

O protocolo descreve o isolamento de fracção FCP total de Cyclotella meneghiniana e incorporação em lipossomas com composição lipídica nativo. O isolamento de tilacoides é altamente reprodutível, mas o rendimento de tilacoides pode mudar. O resultado é aceitável se a mais de 50% de todos os pigmentos são recuperados em etapa 1.1.4. Mais de 80% é o ideal. A solubilização da contém é uma etapa crítica. B…

Discussion

Lipossomas FCP com composição lipídica natural fornecem uma ferramenta útil, simples e reprodutível para investigar Propriedades espectroscópicas in vitro. O ambiente de lipídios em lipossomas FCP assemelha-se a situação dentro da membrana tilacoides, dando origem a resultados experimentais que aproximam-se às condições naturais.

Existem várias vantagens de usar c. meneghiniana como um sistema modelo para antena do FCP. Ele cresce relativamente rápido e é mais …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Rana Adeel Ahmad para assistência na purificação do FCP. Prof Claudia Büchel é reconhecido por discussões úteis e ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã para LD (DI1956-1/1) e a Fundação Humboldt para uma bolsa de Feodor Lynen para ld.

Materials

500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge Heraeus
Bead Mill VI 2 Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm Sigmund-Lindner.com 5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm Sigmund-Lindner.com 4504
VitraPOR filter funnel – por1 ROBU GmbH 21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE Sorvall n.a.
rotor T 865 ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) 51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved) Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7) Optik-Pro (optik-pro.de) 51428
optical glass cuvettes (6040-OG) Hellma Analytics (hellma-analytics.com) "6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) Jasco (jasco.de) V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside ANATRACE (anatrace.com) D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 344061
rotor AH629-17-mL ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) 54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff Millipore (merckmillipore.com) 4307
Biometra Minigel-Twin Analytik Jena AG (analytik-jena.de) 846-010-100
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad (bio-rad.com) 1610449
libre office spread sheet The document foundation https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) Hellma Analytics (hellma-analytics.com) 101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) Jasco (jasco.de) FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load ROTH (carlroth.com) K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside ANATRACE (anatrace.com) O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1300 make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1310 make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1230 make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) Larodan AB (larodan.com) 37-0150 make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) P3782 SIGMA make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH Sonicor (getmedonline.com SONICOR-S-50TH
mini-Extruder Avanti Polar Lipids (Avanti.com) 610000
Nuleopore polycarbonate membrane Avanti Polar Lipids (Avanti.com) 610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff ROTH (carlroth.com) 0653.1 boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent Biorad (Bio-rad.com) 152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer – Ficoll 400 Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 252150
rotor TFT 80.4 Millipore (merckmillipore.com) 54356
material listed in order of appearance
For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.
Standard lab material and substances are not listed.

References

  1. Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
  2. Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
  3. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
  4. Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  5. Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
  6. Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
  7. Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
  8. Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
  9. Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
  10. Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
  11. Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -. L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
  12. Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
  13. Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
  14. Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
  15. Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
  16. Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
  17. Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
  18. Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
  19. Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
  20. Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
  21. Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
  22. Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
  23. Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
  24. Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
  25. Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
  26. Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
  27. Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
  28. Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
  29. Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
  30. Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
  31. Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
  32. Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
  33. Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
  34. Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
  35. Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
  36. Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
  37. Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
  38. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
  39. Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
  40. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pieper, K., Gundermann, K., Dietzel, L. Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids. J. Vis. Exp. (138), e58017, doi:10.3791/58017 (2018).

View Video