Изоляция и включения светособирающего антенны от диатомовые водоросли Cyclotella Meneghiniana в липосомах с липидами тилакоидов

Фотосинтетических организмов, таких как диатомовые водоросли должны справиться с постоянно меняющейся освещенности и реагировать с адаптационного сложные механизмы, которые поддерживать высокую эффективность фотосинтеза и защищать от фото окислительных повреждений, вызванных чрезмерным свет. Основной свет защитные процесс в фотосинтетические eukaryotes является высокой энергии закалочные (q_E) поглощается света, который возникает как главный вклад не фотохимического тушения (ЕНОЛ) под легкий стресс условия^{1,2 ,3}. Света уборки антенные комплексы (LHC) участвуют в регуляции пути передачи энергии возбуждения. В ответ на высокий свет индуцированной низкий рН в просвете хлоропластов, Антенные переключатели системы от света уборки тушения состояние. Этой энергии диссипативных государство защищает фотосистемы (PS) и других комплексов в тилакоидной мембране от фото окисления. В фотосинтетической эукариот q_E индуцируется обычно двух факторов^1,2,3. Одним из факторов является специализированным свет уборки белок, который реагирует с низким рН. ОВО белка индуцирует д_Е в высших растений⁴. LhcSRs⁵, модулированные деятельности ОВО, побудить д_Е в зеленых водорослей⁶. Диатомовые водоросли обладают Lhcx подобных белков, структурно связанные с LHCSRs^7,8,9,10.

Второй фактор q_E является цикл Ксантофилл где преобразован в форму фото защитные деэпоксидации и вернулась эпоксидирования каротиноиды антенны. В растениях и зеленые водоросли виолаксантина преобразуется в зеаксантин. В диатомовых водорослей diadinoxanthin преобразуется в diatoxanthin, который затем коррелирует с степень ЕНОЛ¹¹. Диатомовые водоросли света уборки антенна обладает некоторые особенности, хотя это эволюционный, относящиеся к заводе и водорослей LHCs. Переход от света, заготовки для фото защиты чрезвычайно быстрый и ЕНОЛ способности выше по сравнению с растений¹². Это может быть одной из причин, почему диатомеи очень успешно в различных экологических ниш в пути, что они отвечают за до 45% океанических чистой первичной продукции¹³. Таким образом диатомовые водоросли света уборки систем являются интересным объектом исследований фотосинтеза.

Диатомовые водоросли, как ориентированных видов Cyclotella meneghiniana, обладают тилакоидов внутренние свет заготовки систем, названный пигменты они связывают – фукоксантин, хлорофилла (ХЛ) a и c, поэтому FCP. света уборки белков, например FCPs, являются Встроенный в системе мембрана тилакоида состоит из нескольких слоев мембраны. Диатомовые водоросли образуют полосы три тилакоидов. Этот комплекс положение делает его трудным для их изучения на молекулярном уровне в тилакоидной мембраны. Кроме того многие компоненты способствуют регуляции света уборки (см. выше). Таким образом во многих подходов, комплексы были изолированы от мембраны, используя мягкий моющих средств, таких как н додецил β-D-maltopyranoside (β-DDM), который солюбилизировать последнего мембраны, но сохраняют FCP комплексов. Многие спектроскопические исследования были проведены с использованием растворимых FCP расследовать внутримолекулярной энергии передачи^14,,1516,17. Однако этот бывший подход был ограничен, поскольку регулирование передачи энергии экситонных взаимодействие с другими антенные комплексы или фотосистемы. Следовательно, эти виды исследований не могут осуществляться с растворимых комплексов потому, что взаимодействие между комплексами теряется.

Важной особенностью в положении антенна является «молекулярная вытеснения» антенны и фотосистем в тилакоидной мембраны¹⁸. Ранее, простой подход было проведено, чтобы имитировать этот эффект в пробирке. Был удален моющих средств, что приводит к случайным агрегации антенных комплексов. Хотя некоторые разумные данных было получено^17,этот подход¹⁹, моющего средства удаления не отражает ситуацию в естественных условиях и имеет некоторые ограничения, поскольку комплексы не взаимодействующих в их регулярных третичный структура.

Использование липосомы преодолевает несколько бывших ограничений. Третичная структура по-прежнему полностью нетронутыми. Липосомы мембраны обеспечивает квази родной среде для антенных комплексов. Мембрана отделяет внутри липосом из внешней среды. Этими средствами липосомы предоставляют две реакции отсеков для исследований Ион и pH градиентов, а также транспортных процессов. Кроме того параметры экспериментальной системы могут контролироваться более легко исследований в тилакоидной мембраны. Уже показано, что липосомы были отличным инструментом для изучения фотосинтетической комплексов. Основное внимание в прошлом был на заводе LHC, где влияние изменения липидного состава был протестирован на LHC II²⁰. В других подходов протеин протеина взаимодействия между различными LHC II были исследованы²¹. Кроме того, некоторые в зеленых водорослей были проведены исследования описывают, спонтанное кластеризации между LHC²². Учитывая важность диатомовых водорослей для водных экосистем относительно немногие исследования проводились с антенные комплексы диатомовых водорослей. Два исследования исследованы антенные комплексы ориентированных Cyclotella meneghiniana, где были показаны кластеризации FCP антенна²³ и оперативности FCP электрохимических градиентов²⁴ . Таким образом липосомы являются отличным инструментом для изучения взаимодействия диатомовых антенн и их регулирования в условиях почти родной. Липосомы универсальны, поскольку многие условия, такие как липидного состава, липосомы размер, плотность белка и окружающей водной фазе может контролироваться. Кроме того этот метод требует низкого количества образцов. Экспериментальная система является надежной и высокую воспроизводимость. Изолированность липосомы позволяет для изучения рН и Ион градиенты, которые являются важными факторами в регулировании антенных комплексов.

Здесь мы описываем изоляции FCP антенных комплексов с C. meneghiniana и их включения в липосомах с естественным тилакоидов липидный состав. Кроме того мы предоставляем образцовые данные для спектральные характеристики растворимых FCP и сравнить их с FCP в липосомах. Метод обобщает знания и стандартизованных протоколов, полученные от улучшения Гундерманн и бушель 2012²³, Натали et al. 2016²²и²⁴Ахмад и Дицеля 2017.

Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса. (1) относится к пункту 1, который описывает рост клеток, нарушения и изоляции тилакоид с following FCP разделения на градиенты плотности сахарозы; C. м. –Cyclotella meneghiniana клетки. (2) приготовления смеси натуральных тилакоидов липидов (MGDG, DGDG и SQDG) описано в пункте 2 и создание мицелл липидов-моющего средства с octylglycoside (ОГ). Размер определенный липид мицеллы достигается методом экструзии, с использованием определенной поры диаметром мембраны. FCP и липидов мицеллы унифицированы на предопределенные липидов: соотношение белка и моющих средств, ОГ и β-DDM будут удалены через контролируемые диализа, образуя FCP proteoliposomes. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.