Summary

Isolant et en incorporant des antennes de lumière de diatomée Cyclotella Meneghiniana dans les Liposomes avec thylakoïdes des lipides

Published: August 28, 2018
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Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler des protéines de liaison d’a/c du chlorophylle fucoxanthine (PCF) de diatomées et de les incorporer dans des liposomes dont la composition lipidique naturel pour étudier le transfert de l’énergie d’excitation sur les changements de composition ionique.

Abstract

Le rendement photosynthétique des plantes, algues et diatomées dépend fortement de la régulation rapide et efficace de la récolte et l’énergie lumineuse des processus de transfert dans la membrane des thylakoïdes des chloroplastes. La lumière récolte antenne de diatomées, qu’on appelle la fucoxanthine chlorophylle a/c les protéines liant la (PCF), sont nécessaires pour l’absorption de la lumière et un transfert efficace de la réaction photosynthétique centres aussi bien en ce qui concerne la photo-protection contre la lumière excessive. Le commutateur entre ces deux fonctions est une question de longue date de la recherche. Bon nombre de ces études ont été réalisées avec PCF dans les micelles de détergent. Pour les études sur les interactions, les détergents, qui a conduit à une agrégation imprécise des complexes du PCF, ont été supprimées. Dans cette approche, il est difficile de distinguer les objets et données physiologiquement pertinentes. On trouvera donc plus de précieuses informations sur FCP et autre liés à la membrane de lumière récolte complexes par l’étude des interactions protéine-protéine, de transfert d’énergie et d’autres caractéristiques spectroscopiques si ils sont intégrés dans leur environnement natif de lipides. Le principal avantage est que les liposomes ont une taille définie et un ratio de lipides/protéines déterminées par laquelle l’étendue de la FCP clustering est contrôlée. En outre, changements dans la composition de pH et des ions qui régulent la lumière récolte in vivo peuvent facilement être simulées. Par rapport à la membrane des thylakoïdes, les liposomes sont plus homogène et moins complexe, qui le rend plus facile à obtenir et à comprendre les données spectroscopiques. Le protocole décrit la procédure d’isolement du PCF et purification, préparation de liposome et incorporation du PCF dans les liposomes avec composition lipidique naturel. Résulte d’une application typique sont donnés et discutés.

Introduction

Organismes photosynthétiques tels que les diatomées doivent faire face aux conditions de lumière changeantes et répondre avec des mécanismes sophistiqués d’acclimatation qui soutiennent haut rendement photosynthétique et protègent contre la photooxydation dommages causés par la lumière excessive. Un important processus de lumière protectrice chez les eucaryotes photosynthétiques est la haute énergie trempe (qE) de la lumière absorbée qui apparaît comme la principale contribution à la trempe non photochimique (QNP) sous stress léger conditions1,2 ,3. Les complexes d’antenne récolte léger (LHC) sont impliqués dans la régulation des voies de transfert énergie excitation. En réponse à la forte luminosité induite par un faible pH dans le lumen du chloroplaste, les commutateurs de système d’antenne de la récolte à l’état de désactivation de la lumière. Cet état d’énergie dissipative protège les photosystèmes (PS) et autres complexes dans la membrane des thylakoïdes de photo-oxydation. Chez les eucaryotes photosynthétiques, le qE est généralement induit par deux facteurs1,2,3. L’un des facteurs sont la lumière spécialisée protéine qui répond au faible pHde récolte. La protéine de l’OSP induit le qE dans les plantes supérieures4. LhcSRs5, modulé par l’activité de l’OSP, induire le qE dans algues vertes6. Les diatomées possèdent des protéines de type Lhcx qui structurellement apparentés aux LHCSRs7,8,9,10.

Le deuxième facteur de qE est le cycle de la xanthophylle où caroténoïdes de l’antenne sont convertis sous une forme de protection photo par de-époxydation et rétablis par époxydation. Chez les plantes et les algues vertes, violaxanthine est converti en zéaxanthine. Dans les diatomées, diadinoxanthine est converti en diatoxanthine, qui ensuite est en corrélation avec la mesure de QNP11. La lumière de diatomées récolte antenne possède quelques particularités, bien qu’il soit évolutif relative aux plantes et algues LHCs. L’interrupteur de la lumière récolte photo-protection est extrêmement rapide et la capacité de QNP est plus élevé comparée aux plantes12. Cela pourrait être une des raisons pourquoi les diatomées sont très réussies dans des niches écologiques différentes dans la manière dont ils sont responsables de jusqu’à 45 % de la production primaire nette océanique13. Diatomées légers, systèmes de récolte sont donc un objet intéressant de recherche de la photosynthèse.

Diatomées, comme les espèces centrée sur Cyclotella meneghiniana, possèdent des thylakoïdes lumière intrinsèque systèmes nommés après les pigments qu’ils se lient – fucoxanthine, chlorophylle (chl) a et c, donc lumière PCF. récolte des protéines, tels que les FCP, sont intégré dans le système de membrane de thylakoid formée de plusieurs couches de membrane. Diatomées forment des bandes de trois thylakoïdes. Ce complexe situation, il est difficile de les étudier au niveau moléculaire dans la membrane des thylakoïdes. En outre, de nombreux composants contribuent à la régulation de la lumière récolte (voir ci-dessus). Donc, dans beaucoup d’approches, les complexes ont été isolés de la membrane à l’aide d’un détergent doux, tels que n-dodécyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), qui solubiliser la membrane, mais préserver les complexes du PCF. Beaucoup d’études spectroscopiques ont été effectuées à l’aide du PCF solubilisé pour enquêter sur le transfert d’énergie intramoléculaire14,15,16,17. Cependant, cette première approche était limitée, étant donné que le règlement du transfert d’énergie doit être excitonique interaction avec d’autres complexes d’antenne ou les photosystèmes. Par conséquent, ces sortes d’études ne peuvent être effectués avec solubilisée complexes parce que l’interaction entre les complexes est perdue.

Une caractéristique importante dans le règlement de l’antenne est « l’encombrement moléculaire » de l’antenne et les photosystèmes dans la membrane de thylakoid18. Auparavant, une approche simple a été réalisée pour simuler cet effet in vitro. Le détergent a été supprimé, ce qui conduit à l’agrégation aléatoire des complexes d’antenne. Bien que certaines données raisonnables a été obtenues par cette approche17,19, la suppression de détergent ne reflète pas la situation in vivo et a quelques limitations, étant donné que les complexes ne sont pas interagir dans leurs tertiaires réguliers structure.

L’utilisation de liposomes surmonte plusieurs des anciennes limites. La structure tertiaire est toujours intacte. La membrane du liposome fournit un environnement quasi natif pour les complexes d’antenne. La membrane sépare l’intérieur du liposome de l’environnement extérieur. Par ces moyens, liposomes offrent deux compartiments de réaction pour les études des gradients ioniques et pH aussi bien en ce qui concerne les processus de transport. En outre, les paramètres du système expérimental peuvent être contrôlés plus facilement pour les études dans la membrane des thylakoïdes. Liposomes se sont déjà avérées être un excellent outil pour l’étude des complexes de la photosynthèse. Une préoccupation majeure dans le passé était sur plante LHC où il a été testé l’effet de la composition lipidique altéré le LHC II20. Dans les autres approches, interaction protéine-protéine entre différents LHC II ont été étudiées21. En outre, certaines études chez les algues vertes ont été réalisées qui décrivent un regroupement spontané entre LHC22. Compte tenu de l’importance des diatomées pour les écosystèmes aquatiques, relativement peu d’études ont été réalisées avec des complexes de l’antenne de diatomées. Deux études ont analysé les complexes d’antenne de la centrée sur Cyclotella meneghiniana, où le regroupement de la FCP antenne23 et la réactivité du PCF aux gradients électrochimiques24 apparaissaient. Ainsi, les liposomes sont un excellent outil pour étudier les antennes de diatomées et de leur interaction et règlement dans des conditions presque natives. Les liposomes sont versatiles depuis plusieurs conditions telles que la composition lipidique, taille de liposome, densité de protéine et la phase aqueuse environnante peut être contrôlée. En outre, la méthode nécessite de faibles quantités d’échantillons. Le système expérimental est robuste et hautement reproductible. Le cloisonnement des liposomes permet pour l’étude de pH et gradients ioniques, qui sont d’importants facteurs dans la régulation des complexes d’antenne.

Nous décrivons ici l’isolement des complexes d’antenne du PCF de c. meneghiniana et leur incorporation dans les liposomes avec composition lipidique naturel thylakoïdes. Aussi, nous fournissent des données exemplaires pour la caractérisation spectroscopique du PCF solubilisée et comparez-les avec le PCF dans les liposomes. La méthode résume les connaissances et les protocoles normalisés obtenus des améliorations de Gundermann et Büchel 201223, Natali et coll. 201622et Ahmad et Dietzel 201724.

Figure 1
Figure 1 : représentation schématique du flux de travail. (1) fait référence au paragraphe 1, qui décrit la croissance cellulaire, perturbation et l’isolement des thylakoïdes avec post-séparation FCP sur des gradients de sucrose de densité ; M. c. -Cellules deCyclotella meneghiniana . (2) préparation du mélange de lipides naturels thylakoïdes (MGDG, corentin et SQDG) décrit au paragraphe 2 et la création des micelles de lipide-détergent avec octylglycoside (OG). Une taille définie lipide-micelle est obtenue par extrusion à l’aide de membranes d’un diamètre de pore définis. FCP et lipides-micelles sont unifiés à un lipide prédéfini : ratio de protéine et les détergents OG et β-DDM sont supprimés via contrôlée dialyse formant des protéoliposomes du PCF. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

Remarque : Photosynthétiques complexes tels que les FCP sont extrêmement vulnérables à la lumière et de chaleur. Travaillez toujours sur la glace et sous une lumière très faible. 1. isolement du PCF de cellules Isolement de thylakoïdes des cellules meneghiniana c. Grandir c. meneghiniana dans cinq flacons de 500 mL que chacun rempli de 300 mL d’ASP-moyen23,25…

Representative Results

Le protocole décrit l’isolement de la fraction totale de FCP de Cyclotella meneghiniana et incorporation dans les liposomes avec composition lipidique native. L’isolement de thylakoïdes est hautement reproductible, mais le rendement de thylakoïdes peut-être changer. Le résultat est acceptable si plus de 50 % de tous les pigments sont récupérés à l’étape 1.1.4. Plus de 80 % est optimale. La solubilisation…

Discussion

Liposomes FCP avec composition lipidique naturel offrent un outil pratique, simple et reproductible pour étudier les propriétés spectroscopiques in vitro. L’environnement lipidique dans les liposomes FCP ressemble à la situation au sein de la membrane des thylakoïdes, donnant lieu à des résultats expérimentaux qui sont plus proches des conditions naturelles.

Il y a plusieurs avantages de l’utilisation de c. meneghiniana comme système modèle pour antenne FCP. Il …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Rana Adeel Ahmad d’assistance dans la purification du PCF. Prof. Claudia Büchel est reconnu pour les discussions utiles et la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande de recherche à LD (DI1956-1/1) et la Fondation Humboldt pour une bourse de Feodor-Lynen à LD

Materials

500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge Heraeus
Bead Mill VI 2 Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm Sigmund-Lindner.com 5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm Sigmund-Lindner.com 4504
VitraPOR filter funnel – por1 ROBU GmbH 21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE Sorvall n.a.
rotor T 865 ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) 51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved) Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7) Optik-Pro (optik-pro.de) 51428
optical glass cuvettes (6040-OG) Hellma Analytics (hellma-analytics.com) "6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) Jasco (jasco.de) V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside ANATRACE (anatrace.com) D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 344061
rotor AH629-17-mL ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) 54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff Millipore (merckmillipore.com) 4307
Biometra Minigel-Twin Analytik Jena AG (analytik-jena.de) 846-010-100
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad (bio-rad.com) 1610449
libre office spread sheet The document foundation https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) Hellma Analytics (hellma-analytics.com) 101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) Jasco (jasco.de) FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load ROTH (carlroth.com) K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside ANATRACE (anatrace.com) O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1300 make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1310 make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1230 make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) Larodan AB (larodan.com) 37-0150 make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) P3782 SIGMA make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH Sonicor (getmedonline.com SONICOR-S-50TH
mini-Extruder Avanti Polar Lipids (Avanti.com) 610000
Nuleopore polycarbonate membrane Avanti Polar Lipids (Avanti.com) 610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff ROTH (carlroth.com) 0653.1 boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent Biorad (Bio-rad.com) 152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer – Ficoll 400 Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 252150
rotor TFT 80.4 Millipore (merckmillipore.com) 54356
material listed in order of appearance
For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.
Standard lab material and substances are not listed.

References

  1. Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
  2. Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
  3. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
  4. Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  5. Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
  6. Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
  7. Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
  8. Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
  9. Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
  10. Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
  11. Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -. L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
  12. Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
  13. Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
  14. Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
  15. Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
  16. Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
  17. Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
  18. Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
  19. Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
  20. Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
  21. Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
  22. Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
  23. Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
  24. Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
  25. Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
  26. Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
  27. Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
  28. Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
  29. Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
  30. Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
  31. Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
  32. Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
  33. Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
  34. Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
  35. Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
  36. Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
  37. Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
  38. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
  39. Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
  40. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).

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Cite This Article
Pieper, K., Gundermann, K., Dietzel, L. Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids. J. Vis. Exp. (138), e58017, doi:10.3791/58017 (2018).

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