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Immunology and Infection

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57855
, , ,
1Texas A&M Agrilife Center at Dallas, 2Noble Research Center,Oklahoma State University, 3Department of Biology, College of Engineering and Natural Sciences,The University of Tulsa, 4Bioinformatics and Genomics Core Facility, Department of Biochemistry and Molecular Biology,Oklahoma State University

Summary

Aquí presentamos un nuevo enfoque para identificar virus con genomas de ADN de doble cadena. Usamos métodos estándar para extraer el ADN y el ARN de hojas infectadas y llevar a cabo la secuenciación de próxima generación. Herramientas bioinformáticas montan secuencias en contigs, identifican contigs representación de genomas del virus y asignan genomas a grupos taxonómicos.

Abstract

Este enfoque del metagenoma se utiliza para identificar virus con genoma de ADN circular y sus transcripciones. A menudo virus de ADN de plantas que se producen en títulos bajos en su host o no pueden ser inoculadas mecánicamente a otro host son difíciles de propagar para lograr una mayor concentración de material infeccioso. Hojas infectadas son en un tampón suave con pH óptimo y composición iónica recomendado para purificar más retrovirus de párr de baciliforme. La urea se utiliza para romper los cuerpos de inclusión que atrapan a los viriones y disolver los componentes celulares. Centrifugación diferencial proporciona más separación de viriones de contaminantes de la planta. Luego tratamiento de proteinasa K elimina la cápsida. Entonces el ADN viral es concentrado y usado para la secuenciación de próxima generación (NGS). Los datos NGS se utilizan para armar contigs que son sometidos a NCBI-BLASTn para identificar un subconjunto de secuencias del virus en el conjunto de datos generado. En una tubería paralela, ARN es aislada de hojas infectadas utilizando un método de extracción basado en la columna estándar RNA. Luego agotamiento del ribosoma se lleva a cabo para enriquecer para un subconjunto de transcritos de ARNm y virus. Montado secuencias derivadas del ARN (RNA-seq) de la secuencia fueron sometidas a NCBI-BLASTn para identificar un subconjunto de secuencias del virus en este conjunto de datos. En nuestro estudio, se identificaron dos genomas relacionados badnavirus integral en los dos conjuntos de datos. Este método es preferido a otro enfoque común que los extractos de la población total de pequeñas secuencias de ARN para la reconstitución de secuencias genómicas de virus de plantas. Este último metagenómica tubería recupera virus relacionados con las secuencias que se insertan elementos retro-transcripción en el genoma de la planta. Esto junto a los análisis bioquímicos o moleculares más discernir los agentes infecciosos activamente. El método documentado en este estudio, recupera secuencias representativas de replicar virus que probablemente indican infección activa del virus.

Introduction

Enfermedades emergentes conducen los investigadores a desarrollar nuevas herramientas para identificar el agente causal correcta. Informes iniciales de enfermedades virales nuevos o recurrentes se basan en los síntomas que comúnmente ocurren como mosaico y de malformaciones de la hoja, vena claro, enanismo, marchitez, lesiones, necrosis, u otros síntomas. El estándar por informar de un nuevo virus como el agente causal de una enfermedad es diferenciarlo de otros patógenos contaminantes, propagar en el huésped adecuado y reproducir la enfermedad por inoculación en plantas sanas de la especie original. La limitación de este enfoque es que muchos géneros de virus de plantas dependen de un insecto u otros vectores para la transmisión a un huésped adecuado o a la especie original. En este caso, la búsqueda para el vector apropiado puede ser prolongada, puede haber dificultades para establecer colonias de laboratorio del vector, y más esfuerzos son necesarios para elaborar un protocolo para la transmisión experimental. Si las condiciones de los estudios de transmisión de laboratorio exitoso no se logra, entonces la obra incumple la norma por informar de una nueva enfermedad de virus. Los virus que se producen en sus hospederos naturales a muy bajas concentraciones, los investigadores deben identificar hosts alternativos de propagación para mantener suficientes existencias infecciosas para llevar a cabo la investigación. Para especies de virus que infectan sólo algunas plantas también esto puede ser un obstáculo para el crecimiento de cultivos stock1.

En los últimos años, los científicos son más a menudo que emplean NGS de alto rendimiento y metagenómica enfoques para descubrir secuencias de virus que están presentes en el ambiente, que puede existir sin relación a una enfermedad conocida, pero puede ser asignado a géneros y especies taxonómicas 2 , 3 , 4. estos enfoques el descubrimiento y clasificación de material genético en un ambiente distinto proporciona una manera de describir la diversidad de virus en la naturaleza o su presencia en un determinado ecosistema pero no necesariamente confirma un marco para la definición de agentes causales de una enfermedad evidente.

El género Badnavirus pertenece a la familia Caulimoviridae de pararetrovirus. Estos virus son baciliforme en forma con genoma de ADN circular de doble cadena de aproximadamente 7 a 9 kb. Los pararetrovirus replican a través de un intermediario de RNA. Pararetrovirus existen como episomas y replican independientes de la planta cromosómico DNA5,6. Estudios de campo de poblaciones de virus indican que las poblaciones de estos virus son genéticamente complejas. Además, la información obtenida a través de una gama de genomas de plantas mediante secuenciación de alto rendimiento han descubierto numerosos ejemplos de fragmentos de genoma de badnavirus insertados por eventos de integración ilegítimo en genomas de plantas. Estas secuencias endógenas badnavirus no están necesariamente asociadas con infección7,8,9,10,11. Posteriormente, el uso de NGS para identificar nuevos badnaviruses como el agente causal de la enfermedad es complicado por la diversidad de la subpoblación de genoma episomal, así como la aparición de secuencias endógenas12,13.

Mientras que hay no una tubería óptima para el descubrimiento de los genomas de pararetrovirus novela, hay dos métodos comunes para identificar estos virus como agentes causales de enfermedad. Un método es enriquecer para pequeñas secuencias de ARN de hojas infectadas y luego montar estas secuencias para reconstituir el virus genome(s)14,15,16,17. Otro enfoque es la amplificación de círculo rodante (RCA) para amplificar genomas de virus de ADN circular18. El éxito de RCA depende de la edad de la hoja y el título del virus en el tejido seleccionado. Los productos RCA son sometidos a digestión de restricción y clonados en plásmidos para directo secuencia19,20,21.

Virus del moteado amarillo de Canna (CaYMV) es un badnavirus y se describe como la causa etiológica de la enfermedad del moteado amarillo en canna, aunque sólo un fragmento de 565 PB del genoma ha sido previamente aislado de cannas infectados22. Un estudio contemporáneo identificado CaYMV de Alpinia purpurata (jengibre de floración; CaYMV-Ap)23. El objetivo de este estudio fue recuperar las secuencias del genoma completo badnavirus de lirios de canna infectados. Describimos un protocolo para la purificación de virus de los contaminantes de la planta y luego aislar DNA viral de esta preparación y preparar una biblioteca de DNA para el uso de NGS. Este enfoque elimina la necesidad de pasos intermedios de amplificación molecular. También aislamos mRNA de plantas infectadas para NGS RNA-seq., que incluye RNA-seq se realizó con cada preparación de ácidos nucleicos. Contigs montados se encontró que se refieren a la taxonomía de Badnavirus en ambos conjuntos de datos con el Centro Nacional de biotecnología y la información (NCBI) herramienta de búsqueda de alineación local básico para los ácidos nucleicos (BLASTn). Se identificaron los genomas de dos badnavirus especies24.

Protocol

1. general Virus purificación por centrifugación diferencial usando el método estándar por Covey et al. 25 En primer lugar, cortar 80-100 g de hojas de plantas enfermas y moler en la licuadora waring a 4 ° C con 200 mL de tampón de pulir (0,5 M NaH2PO4, 0,5 M Na2HPO4 (pH 7.2). y el 0.5% (p/v) Na2SO3). Utilice una capa de laboratorio y guantes para todos los pasos de este procedimiento. Luego, traslado el homogeneizado (300 mL) a un matraz de 1.0 L. Añadir 18 g de urea y 25 mL de detergente no iónico al 10% (t-Oct C6H4-(OCH2CH2)9OH) al homogeneizado dentro de una campana química.Nota: Para este paso es mejor usar gafas protectoras y una mascarilla simple para la protección personal. Revuelva con un agitador magnético brevemente en la campana y cubrir el vaso con el papel de aluminio. El vaso de papel cubierto, transfiera a una habitación fría y revuelva con un agitador magnético durante la noche a 4 ° C. Transferir el homogeneizado para botellas (envases de 250 mL) de rotor de centrífuga, centrífuga de un rotor de ángulo fijo a 4.000 x g por 10 min a 4 ° C. En una campana de vapores químicos, recuperar el sobrenadante y el filtro a través de 4 capas de Gasa. Dividir el homogeneizado entre tubos de centrífuga de polipropileno de 38,5 mL y centrifugar durante 2,5 h a 40.000 x g a 4 ° C. Por lo general, comprobar la presencia de un perdigón verde en la parte inferior del tubo y una pelotilla blanca a lo largo de la longitud del tubo. Retirar el sobrenadante y conservar ambas pelotillas; Coloque las muestras en hielo.Nota: La pastilla verde contiene almidón y cloroplastos y otros organelos. Trabajar en una campana química, usar a un policía de goma para separar las pastillas. Resuspender el precipitado blanco en cada botella de rotor en 1 mL de ddH2O en el transcurso de 1-2 h, manteniendo que las suspensiones durante la noche a 4 ° C para permitir que los materiales que se disuelven completamente en solución. Centrifugar la suspensión a 6.000 x g y a 4 ° C por 10 min eliminar los residuos restantes. Centrifugue la suspensión concentrada a 136.000 x g durante 2 h a 4 ° C para que sedimenten viriones. Resuspender el pellet en 1 mL de tampón (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl2).Nota: Es un paso opcional para el tratamiento de viriones con DNasa I (10 μg/mL) durante 10 min a 37 ° C para eliminar no encapsula ADN, es decir, contaminando el cloroplasto y la DNA mitocondrial. Inactive, la DNasa I mediante la adición de EDTA 1 mm. Interrumpir los viriones con 40 μl de 2 μg/μl proteinasa K a 37 ° C durante 15 minutos. Trabajar dentro de una campana química para recuperar ADN virión por extracción orgánica. Use una careta, guantes y un abrigo de laboratorio durante la extracción para la protección contra efectos de salud agudos. Agregar 1 volumen de fenol-cloroformo-isoamyl alcohol (49:50:1) a la muestra y agitar manualmente durante 20 s. Centrifugar a temperatura ambiente por 5 min a 16.000 x g. quitar la fase acuosa superior y transfiéralo a un tubo nuevo. Repetir la extracción dos o más veces. Deseche la fase orgánica colocándola en una botella de residuos de vidrio para eliminación adecuada de productos químicos institucionales26. Concentrar el ADN mediante precipitación del etanol. Utilizar la concentración final de 0,3 M de acetato de sodio (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 95%. Colocar las muestras a-20 ° C durante 30-60 min y centrifugar a 13.000 x g por 10-20 min a la pelotilla de la DNA26. Trabajar en un banco de laboratorio, Resuspender el precipitado de DNA en 1 mL de tampón TE de 0,1 mM (pH 8.0). Filer la suspensión a través de una columna de filtración de gel comercial (normalmente utilizada para la reacción en cadena de polimerasa (PCR) limpieza) para eliminar sales y material de bajo peso molecular que podría impedir NGS. Las muestras a analizar por electroforesis del gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio tinción para ver la calidad de las preparaciones. Evaluar la calidad de ADN utilizando un espectrofotómetro nanodrop.Nota: Una relación de absorbancia de la muestra a 260 λ y λ 280 entre 1.85 y 2,0 típicamente indica que la preparación es “limpio” de impurezas y es de la calidad deseada. Analizar la calidad del ADN (usar pg 5 a 10 ng) usando un chip basado en instrumento de electroforesis capilar.Nota: Salida de la calidad muestra limpiamos picos que representan fragmentos de la DNA por tamaño a lo largo de un eje. Altura máxima indica abundancia del fragmento. Picos puntiagudos indican fragmentos parcialmente degradadas o contaminantes químicos. Curvas redondas representan un borrón de transferencia de ADN que indica mala calidad 2. Biblioteca preparación usando ADN y amplificación Clonal de emulsión (emPCR amplificación) Nota: La biblioteca se prepara normalmente por un centro de NGS, que realiza un trabajo orientado al cliente. Una solución de ADN (> 200 ng) usando un nebulizador que convierte el ADN en fragmentos del esquileo. Ligar los adaptadores comerciales según instrucciones27 del manual. Llevar a cabo emPCR amplificación de la muestra de ADN según las instrucciones28,29,30 el fabricante. Repetir el lavado tres veces y después de cada lavado, la pelotilla los granos en un minicentrifuge para descartar s. 10 el sobrenadante después de cada lavado.Nota: El procedimiento comienza con la preparación de los granos de captura por lavado en el tampón de lavado comercial suministrado con el kit. emPCR es comúnmente utilizado para la amplificación de plantilla para NGS. Calor desnaturaliza el DNA o RNA a 95 ° C durante 2 minutos y luego 4 ° C hasta que esté listo para usar. Uso 200 millones de moléculas de ADN/ARN para captura de 5 millones de cuentas en un volumen final de 30 μl. preparan una muestra simulada junto a la muestra de ADN/ARN y llevar a cabo los siguientes pasos con la muestra de ácido nucleico, así como la muestra simulada. Realizar la emulsificación por Vortex el tubo de emulsión de aceite de para 10 s a velocidad máxima, luego vierta todo el contenido (4 mL) un plástico revolviendo tubo que es compatible con un homogeneizador de la plataforma. Coloque el tubo de agitación en la plataforma para mezclar la emulsión a 2.000 rpm por 5 minutos. Dispensar 100 alícuotas de μl de emulsión en tubos con tapón de 8-tira o en una placa de 96 pocillos. Tapa los tubos o sellar la placa y llevar a cabo emPCR con programa recomendable28 del fabricante.Nota: Después de la polimerización en cadena es completa, verifique los pozos para ver si la emulsión es intacta y entonces proceder. Deseche todo bien si la emulsión se rompe. Usar una bata de laboratorio y trabajar en una campana química para recoger los granos de ADN amplificados (ADB). Vacío la emulsión de los pozos de aspirar y recoger los granos en un tubo de 50 mL. Enjuague los pozos dos veces con 100 μl de isopropanol y aspirar el enjuague en el mismo tubo de 50 mL. La recogida de vórtice emulsiones y resuspender el Bad con isopropanol hasta un volumen final de 35 mL. Pellets de Bad a 930 x g durante 5 minutos Retire el sobrenadante y añadir 10 mL de buffer de mejorar. Mezclar el Bad y luego lavado añadiendo isopropanol a volumen final de 40 mL centrifugar y descartar el sobrenadante después de cada lavado y repetir dos veces la etapa de lavado. Llevar a cabo un último lavado con etanol en lugar de isopropanol. Añadir aumentar buffer a 35 mL de volumen final, vortex y pellets los granos a 930 x g por 5 min Quite el sobrenadante pero dejo 2 mL de tampón de mejorar. Transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga y centrifugar brevemente para el Bad de la pelotilla. Después de descartar el sobrenadante, enjuague la pelotilla ADB dos veces con 1 mL de tampón mejora. Centrifugar y descartar el sobrenadante después de cada lavado. Para prepararse para el enriquecimiento de grano biblioteca de ADN, añadir 1 mL de NaOH N 1 a las cuentas. Vórtice el Bad y luego incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Centrifugar y descartar el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez. Añadir 1 mL de tampón de recocido, entonces el vórtice el Bad e incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Brevemente, centrifugar y descartar el sobrenadante. Repita este paso otra vez con 100 μl de tampón de recocido. Para Recueza primers de la secuencia del ADN, añadir 15 μl del Seq Primer y 15 μl de Seq cartilla B proporcionadas en el kit. Mezclar con un vórtex y coloque el tubo de microcentrífuga en un bloque de calor a 65 ° C por 5 min transferencia de hielo durante 2 minutos. Lavar tres veces con 1.0 mL de buffer de recocido. Vortex por 5 s y descartar el sobrenadante cada vez. Antes de la secuencia, medir el número de granos utilizando un contador de grano comercial. Debe haber por lo menos 500.000 granos enriquecidos.Nota: El contador de bolas es un dispositivo especial que mide los granos en un tubo de microcentrífuga suministrado. 3. general mRNA aislamiento y síntesis a partir de infectados Canna deja que prueba RT-PCR para diagnóstico reportado CaYMV utilizando Primers dsDNA Use una capa de laboratorio y guantes de látex para protección personal en todas las etapas posteriores. Trabajar en un banco de laboratorio, recoge 12 muestras de las hojas y sumergen las muestras en nitrógeno líquido. Utilizar un molino de grano para la homogeneización. Utilice un kit comercial que proporciona un método estándar de base de columna para aislamiento de RNA total de la planta. Añadir el tampón de lisis de isotiocianato de guanidina proporcionado por el kit para la muestra de suelo y agitar por 20 s. Añadir etanol y mezclar bien, según las instrucciones del kit. Añadir cada homogenado a una columna de spin que se une la RNA a la membrana. Lavar tres veces y eluir el RNA en un tubo de recuperación24. Cuantificar el RNA usando un espectrofotómetro para medir la relación de absorbancia a λ 260 y 280 λ. Verifique que el RNA integridad usando electroforesis de gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio.Nota: Una relación de absorbancia entre 1.85 y 2.0 indica que la preparación es de la calidad deseada. Tratamiento de ARN con DNasa I (10 μg/mL) durante 10 min a 37 ° C. Utilice una columna de giro comercial para concentrar el RNA en agua libre de ARNasa31. Muestras de piscina RNA antes de proceder. Utilice un kit de eliminación de rRNA para quitar la planta del ARN ribosómico. Granos magnéticos alícuotas al tubo de microcentrífuga y lavado dos veces con Rnasa agua. Vórtice el tubo alícuota para suspender de nuevo, coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere a líquido claro. Desechar el sobrenadante y vuelva a colocar con la solución de resuspensión de grano magnético. Vortex para suspender y añadir 1 μl de inhibidor de la Rnasa.Nota: Estos kits utilizan oligo-dT a bolas magnéticas que hibridan al mRNA. El método utiliza tecnología de separación de grano estándar imán para recuperar las transcripciones24. Combinar 500 ng a 1.25 μg de RNA, agua libre de ARNasa y almacenadores intermediarios de reacción proporcionadas por el kit. Lugar la mezcla durante 10 minutos a 50 ° C. Retirar del fuego y agregar granos magnéticos lavados en agua libre de ARNasa. Mezclar brevemente y conjunto a temperatura ambiente durante 5 minutos. Colocar en un soporte magnético y esperar a que el líquido sea claro. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco. Establecer en el hielo. Utilizar un método de captura basadas en soluciones para enriquecimiento de exosomas y 200 ng de ARN para preparar la biblioteca de cDNA.Nota: La biblioteca de cDNA de doble cadena se prepara normalmente por un centro de NGS, que realiza un trabajo orientado al cliente. Fragmento de ARN utilizando una solución comercial de fragmentación de RNA (0,136 g vivencias2 y 100 mM Tris-HCl pH 7.0). Añadir 2 μl de solución 18 μL de ARN (total de 200 ng). Tubos de centrifugado brevemente en la microcentrífuga, coloque las muestras en 70 ° C por 30 s y la transferencia de hielo. Detener la reacción con 2 μl de 0,5 M EDTA pH 8.0 y 28 μl de 10 mM Tris-HCl de pH 7.5. Lazo de ARN para granos magnéticos mediante la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos utilizar un concentrador magnético para recoger los granos y eliminar el sobrenadante. Lavar los granos tres veces con 200 μL de etanol al 70%. Desechar cada uno Lave y luego secar al aire los granos sedimentados a temperatura ambiente durante 3 minutos resuspender en 19 μl de 10 mM Tris-HCl de pH 7.5. Templar al azar cebadores ARN fragmentado calentando a 70 ° C durante 10 minutos y luego coloque el tubo en hielo por 2 minutos Prepare el primer filamento y segunda del strand cDNA usando un estándar comercial cDNA síntesis kit. Purificar el cDNA de doble cadena utilizando un concentrador de grano magnético. Lavar con 800 μl de etanol al 70% tres veces. Desechar cada uno Lave y seque al aire las pelotillas a temperatura ambiente durante 3 minutos resuspender en 16 μl de 10 mM Tris-HCl de pH 7.5. Utilice el concentrador de grano magnético para separar los granos del cDNA de doble hebra, que se encuentra en solución. Retire el cDNA mediante pipeteo en un nuevo tubo PCR de 200 μl. Llevar a cabo la reparación final de fragmento con Taq polimerasa y una mezcla de desoxirribonucleótidos proporcionada por un kit de preparación de biblioteca comercial. El kit comercial proporciona adaptadores previamente diluidos a añadir a cada extremo del cDNA de doble cadena mediante ligasa comercial a 25 ° C durante 10 minutos. 4. NGS de ADN biblioteca preparados crudos preparación de Virus y dsDNA biblioteca preparado a partir de mRNA Utilizar un instrumento de pirosecuenciación de estándar de alto rendimiento y seguir protocolos todo recomendada del fabricante para generar lecturas directas de secuencias de ADN. Utilizar reactivos de secuenciación comercial, incluyendo nucleótidos fluorescencia marcadas.Nota: Para detalles consulte las instrucciones del fabricante con el instrumento. Llevar a cabo análisis de la secuencia utilizando el software de montaje de genoma que monta automáticamente lee para producir la primera serie de contigs con una longitud media de < 700 BP utilizar el software de FastQC de la Web de iPlant/CyVerse que realiza control de calidad controles sobre los datos de secuencia cruda32. Seleccionar secuencias con Phred puntuación ≥ 30 para continuar reconstruir secuencias más largas de menor secuencia Lee24 través de cartografía y software de productos.Nota: Para detalles consulte instrucciones del fabricante. Presentar estos contigs montados para el análisis de BLASTn NCBI usando MEGABLAST predeterminado módulo así como Viridplantae (TaxID: 33090) y virus (TaxID: 10239) como el organismo limita los nombres de33. Se reúnen la subpoblación de contigs que muestran alta similitud con genomas Badnavirus reportados en un informe. Verificar que los andamios se unió a que representan uno o más genomas de virus completos de candidato, producir correctamente en el marco secuencias que tienen la misma organización como el genoma badnavirus estándar. Para ello, de entrada el genoma del virus candidato completas en un plásmido de software de dibujo. A continuación, confirme los primeros 15 nucleótidos consiste de un tRNAmet (TGGTATCAGAGCGAG) que se conserva altamente entre badnaviruses. Localizar la señal de poliadenilación potenciales cerca del extremo 3′ del genoma. Anotar el genoma completo para identificar la presencia de dos ORFs pequeños y uno grande ORF codifican una poliproteína. Luego use el portal de ExPASy traducir herramienta para identificar los badnavirus ORF1, ORF2 y ORF3 traducción productos34.Nota: Este software científico libre y generar ADN circular, identificar todo abierto de lectura de los marcos y proporciona una salida inmediata para verificar que la secuencia representa el genoma de ADN circular de longitud completa. Herramientas de código abierto múltiples secuencia comparación, músculo y CLUSTALW, para comparar los genomas de virus de DNA y RNA análisis35,36. Buscar la base de datos NCBI nucleótido para obtener las secuencias del genoma completo de 30 badnavirus especies y exportarlos como documento en formato .fasta. Sube imágenes de secuencias a un software que realiza análisis genético evolutivo de secuencias con las secuencias de genoma de virus obtenidas por NGS. Generar múltiples alineaciones de la secuencia y árboles de probabilidad máxima con músculo37. 5. la calidad evaluación de la secuenciación De Novo por amplificación por PCR de los genomas de Virus de plantas infectadas Entrada de las secuencias de genoma badnavirus cuerpo entero nuevamente identificado (.fasta formato) en la herramienta en línea gratuita Primer3 obtener PCR primers38. Identificar conjuntos de cartilla que producirán productos escalonados de 1.000-1.500 PB a lo largo de toda la longitud de la genome(s) de virus. Enviar las secuencias a un centro de servicio que se sintetizan y entregar cartillas PCR.Nota: La salida identifica pares de cartilla aceptable con temperatura de fusión común y aceptable y cartilla precisa ubicaciones a lo largo de las secuencias introducidas. Trabajo en un banco de laboratorio y usando guantes y una bata de laboratorio, aislar 5 μg de ADN de las hojas de control infectado y saludable mediante un método automatizado que consiste en partículas de celulosa paramagnético estándar para aislar ADN de planta material39 . Material de la hoja (20-40 mg) de congelar en nitrógeno líquido en un tubo de microcentrífuga y triturar con ayuda de un molino de grano. Combina la muestra con buffer de lisis en un tubo de microcentrífuga y añadir Rnasa A para cada muestra. Vórtice de la muestra de 10-20 s y brevemente centrifugado la muestra para eliminar las partículas sólidas.Nota: Las partículas paramagnéticas de celulosa tienen gran capacidad de unión al ADN y aislar altos rendimientos de ADN puro. Los métodos de la columna de sílice comercial estándar para el aislamiento de ADN ADN no extraer eficientemente de una gran variedad de especies de plantas. En consecuencia, docenas de métodos existen que son modificaciones de estos procedimientos para mejorar la eficiencia para especies individuales. El método de partículas de celulosa paramagnético automatizado fue elegido porque rinde más y de mejor calidad ADN de más de 25 especies de angiospermas herbáceas40. Utilizar cartuchos de reactivo comercial para aislamiento de DNA paramagnético automatizado. Añadir 300 μL de agua libre de nucleasa a cada reactivo comercial cartucho de transferencia planta y lisado para el mismo cartucho. Coloque el cartucho en el soporte de cartucho, un émbolo en el pozo más cercano al tubo de elución y tampón de elución al tubo de elución. Cartuchos de carga en la máquina de aislamiento de ácidos nucleicos automatizada y ejecutar la planta de ADN aislamiento protocolo41,42. Realizar PCR para derivar un conjunto de productos PCR superpuestos. Utilice 5 μm de cada primer avance y retroceso con 35 ciclos de amplificación por PCR. Utilice las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización a 95 ° C durante 60 s, recocido a 50 ° C por 45 s y extensión a 72 ° C durante 1-2 min con una extensión final a 72 ° C por 7-10 minutos uso una columna de filtración previos de la gel para eliminar sales y material de bajo peso molecular como en el paso 1.231. Calcular un cociente molar 3:1 del producto de PCR a vector para determinar la cantidad del producto de PCR para ligar a 50 ng de plásmido pGEM lineal43. Uso un control insertar ADN para determinar si las trompas funcionan eficientemente. Realizar la ligadura durante la noche con T4 ADN ligasa (3 U/μL) a 4 ° C. Entonces transformar comercialmente preparados competentes JM109 Escherichia coli las células. Uso del control 100 pg de ADN de plásmido sin cortar como control positivo para la transformación eficiente. Placa de 100 μl de las células transformadas en placas de LB-agar con antibióticos y azul/blanco para recuperar plásmidos ligados26. Incubar las placas durante 16-24 h a 37 ° C.Nota: El vector pGEM tiene un gen lacZ, que codifica la β-galactosidasa. Bacterias transformadas en una placa que contiene ampicilina de 100 μg/mL, 0,5 mM IPTG, 80 μg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) dará vuelta al azul debido a la actividad β-galactosidasa. El plásmido pGEM es lineal de forma que interrumpe el gen lacZ . Colonias que contienen los insertos de producto PCR interrumpen al gen lacZ y no metabolizan a X-gal. Estas colonias son de color blancas. Así colonias con un inserto pueden diferenciarse de aquellos sin una inserción por el color de la Colonia (blanco y azul)26. Aislar DNA de tres colonias utilizando un estándar basado en la columna de plásmido aislamiento kit39. Secuencia de tres plásmidos de producto de la transformación. Comparar cada secuencia de la DNA con los genomas de virus de novo montado producidos por NGS. Utiliza CLUSTALW para alinear las secuencias y para asegurar que estén debidamente ordenadas.

Representative Results

Este método de purificación de virus modificado proporciona un enriquecimiento de virus ADN útil para identificar dos especies de virus por NGS y bioinformática. Después el homogeneizado se centrifugó a 40.000 x g durante 2.5 h, hubo una pelotilla verde en la parte inferior del tubo y una pelotilla blanca a lo largo de la longitud. Se resuspendió el precipitado verde en un tubo de microcentrífuga y se resuspendió el sedimento blanco en dos tubos de microcentrífuga. PCR se llevó a cabo usando las cartillas diagnóstico estándar de PCR CaYMV, y los productos fueron detectados en la pelotilla blanca solubilizada y no la pelotilla verde (figura 1A). Una muestra de la preparación del crudo fue examinada por microscopia electrónica de transmisión y observamos las partículas baciliforme mide 124-133 nm de longitud (figura 1B). Esto es dentro de la predicha modal de badnaviruses más. ADN fue extraído de las pelotillas blancas y verdes y suspendido por separado. En la figura 1C, hemos cargado 5 μl de ADN extraído de la verde y muestra pelotilla blanca (1,6 μg de ADN de la fracción verde) y 3,1 μg de ADN para la fracción blanca de agarosa al 0.8% electrophoresis del gel y analizaron el ADN después de bromuro de etidio de tinción. La fracción verde contenía ADN de bajo peso molecular mientras que la fracción blanca produjo dos bandas de peso molecular más alto del ADN, así como el menor peso molecular de ADN (figura 1C). El gel presentado en la figura 1C se ejecutó durante 40 min a 100 V y el frotis en el carril 3 sugiere que la tensión de gel debe reducirse para producir bandas más claras. Estos datos sugieren que la pelotilla blanca se enriqueció de viriones. La concentración de ADN (0.6 μg/mL) extraída de la muestra blanco era bajo, pero suficiente para NGS, que requiere un mínimo de 10 ng de ADN para proceder. ADN fragmentado se utiliza para preparar una biblioteca para NGS. En paralelo, RNA fue extraída de las plantas infectadas canna (figura 1D) para alto rendimiento RNA-seq. Un flujo de trabajo estándar se llevó a cabo para la preparación de la biblioteca, NGS, creación de contigs y la identificación de secuencias del genoma viral (figura 1E). Se compararon los resultados de salida del uso de ADN y ARN como materiales de partida. Se obtuvieron 188.626 lecturas de ADN crudos por NGS usando la DNA aislada de preparación cruda del virus. Lee se reunieron en 13.269 contigs y BLASTn fue utilizado para buscar el conjunto de datos NCBI de secuencias de nucleótidos (usando Viridplantae TaxID: 33090 y Virus TaxID: 10239 como los organismos limitantes) (figura 1E). Los resultados de BLASTn NCBI revelaron que 93% de los contigs de novo montado eran secuencias celulares, 22% eran desconocido, y 0.3% fueron contigs de virus (figura 2A). La mayoría de los contigs categorizado como secuencias celulares fueron identificadas como mitocondrial o ADN del cloroplasto. Dentro del conjunto de datos de virus contigs, 32% de los contigs de virus se relaciona con miembros de Caulimoviridae (que no eran secuencias Badnavirus) y 58% de ellos estaban relacionados con Badnavirus. De los contigs de virus, 29% fueron muy similares (e < 1 x 10-30) para CaYMV aislante V17 ORF3 gene (EF189148.1), virus de baciliforme de la caña de azúcar aislar Batavia D, genoma completo (FJ439817.1), y virus del rayado del banano CA completo (genoma KJ013511). Dentro de esta población, había contigs largos que parecían dos genomas de longitud completa. Alto rendimiento RNA-seq producido 153.488 limpio secuencia individual Lee con un promedio leer longitud de < 500 BP Contig montaje reducido esto a 8.243 contigs. Estos fueron sometidos a NCBI BLASTn (usando Viridplantae TaxID: 33090 y Virus TaxID: 10239 como los organismos limitantes) y las salidas a 76% de los contigs en una categoría de secuencias celulares de la planta, 23% eran desconocidas, y 0.1% fueron categorizados como (contigs) virus Figura 2 B). un examen más cercano de la población de la población de 0.1% de contigs virus determinó que 68% de estos fueron asignado a Caulimoviridae (figura 2B). Se identificaron tres grandes contigs dentro de esta población con alta similitud (e < 1 X 10-30) para CaYMV aislante V17 ORF3 gen (EF189148.1), el virus baciliforme de caña de azúcar aislar D Batavia, genoma completo (FJ439817.1) y Banana streak Virus de CA genoma completo (KJ013511). Examinar los tres contigs, manualmente se unió a dos de estos para producir un genoma de virus completos. Se comparó el virus genoma contigs de longitud producida por secuenciación de ADN y ARN como andamio mutuo para confirmar la presencia de los dos genomas de virus completos. Un genoma de virus completos de 6.966 bp fue nombrado provisionalmente virus del moteado amarillo asociado de Canna 1 (CaYMAV-1) (figura 3A). El segundo genoma fue 7.385 bp y una variante de CaYMV infección de Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (figura 3A). Finalmente, iniciadores PCR que fueron diseñados para fragmento de bp clon ~ 1.000 de cada virus, se utilizaron para detectar diferencialmente dos genomas en una población de 227 plantas de canna que representa nueve variedades comerciales. En muchos casos las plantas individuales fueron infectadas con ambos virus. Le ofrecemos un ejemplo de detección RT-PCR de CaYMAV-1 y CaYMV-Ap01 en 12 plantas. Tres de estos fueron positivos solo para CaYMV-Ap01 y nueve fueron positivo para ambos virus (figura 3B). Figura 1 : Flujo de trabajo NGS y preparaciones de ácido nucleico del virus. (A) agarosa (1.0%) gel electroforesis de los fragmentos PCR bp 565 de genomas de CaYMV. Dos productos PCR fueron detectados en muestras preparadas de la pelotilla blanca (carriles 1, 2) pero no en la muestra de pellet verde (carril 3). Control positivo (+) representa un producto PCR amplificado de planta infectada ADN que fue aislado usando un método automatizado para que las partículas de celulosa paramagnético estándar. L carril contiene la escalera de ADN utilizada como un estándar para medir el tamaño de las bandas de DNA lineales en carriles de muestra. (B) ejemplo de partículas del virus por microscopía electrónica de transmisión en la pelotilla blanca recuperada por fraccionamiento crudo de hojas infectadas de canna. (C) agarosa (0,8%) gel de electroforesis de la DNA se recuperó de la verde (carril 1) y blanco (carril 2) bolitas de ese positivo probado por PCR en panel A. Los puntos rojos y amarillos junto a lane 2 identifican dos bandas de ADN de alto peso molecular que ocurren en la fracción blanca. (D) agarosa (1%) gel de electroforesis de ARN total recuperado por basado en la columna de purificación de RNA. L carril contiene la escalera de ADN utilizada como un estándar para medir el tamaño de bandas lineales en carriles de la muestra. Carriles 1-6 contiene el ARN aislado de hojas de canna infectados que se combinaron para una sola muestra de agotamiento de ribo y tubería esquemática del RNA-SEQ (E) de aislamiento de ácidos nucleicos, preparación de biblioteca, secuencia, montaje contig y genoma del virus descubrimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Gráficas corona visualizar las categorías taxonómicas de contigs. (A) la tabla de la izquierda muestra la abundancia y distribución taxonómica de contigs montados desde la preparación cruda del virus. La tabla de la derecha representa las proporciones de contigs de virus asociados a la familia Caulimoviridae , género Badnavirus y tres especies estrechamente relacionadas. (B) el panel de la izquierda muestra la abundancia de contigs derivado de RNA-seq basado en su distribución taxonómica. A la derecha es el gráfico que representa la abundancia de contigs dentro de la población de contigs de virus asociados a la familia Caulimoviridae , género Badnavirus y tres especies estrechamente relacionadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 . Caracterización de genomas de CaYMAV 1 y CaYMV-Ap01. (A) representación esquemática del moteado amarillo de Canna asociado virus 1 (CaYMAV) y del virus del moteado amarillo de Canna similares al genoma de Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Las posiciones del nucleótido 1-10 se identifica como el comienzo del genoma y contiene un tRNAmet anticodon sitio típico de la mayoría de badnavirus de genomas. Las posiciones de parada y arranque para la traducción de marco de lectura abierto (ORF) 1 y 2 son adyacentes. Estas proteínas tienen desconocido funciones. ORF3 es una poliproteína que contiene dedos de zinc (ZnF), proteasa (Pro), transcriptasa inversa (RT) y dominios Rnasa H. Se conserva una secuencia señal 3′ poly(A) para ambos genomas del virus. (B) análisis de RT-PCR se llevó a cabo utilizando ARN aislado de virus infectadas hojas y primers que detectan CaYMAV y CaYMV-Ap01. En la misma población de 12 plantas, tres fueron infectados con CaYMV-Ap01 solamente, mientras que los restantes fueron infectados con CaYMAV y CaYMV-Ap01. (+) indica control positivo y control negativo (-). Esta cifra es reproducido/modificado de Wijayasekara et al. 24 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En los últimos años se han empleado una variedad de métodos para el estudio de biodiversidad de virus vegetal en ambientes naturales que incluyen enriquecimiento de partículas similares a virus (VLP) o virus específicos ARN o ADN2,3,44, 45,46 . Estos métodos son seguidos por NGS y bioinformáticas de análisis. El objetivo de este estudio fue encontrar al agente causal de una enfermedad común en una planta cultivada. La enfermedad fue divulgada para ser el resultado de un virus desconocido que tiene partículas no-envueltos baciliforme, y que sólo un fragmento de bp 565 ha sido clonado47. Esta información fue suficiente para que los investigadores previos hipotéticamente asignar el virus del género Badnavirus dentro de la familia Caulimoviridae. Mientras que informes anteriores la hipótesis de que la enfermedad del moteado canna en lirios de canna fue el resultado de un badnavirus solo, utilizando el enfoque de metagenómica planteado en este estudio, se determinó que la enfermedad era causada por badnavirus provisional dos especies24. Por lo tanto, la fuerza de la utilización de un metagenoma enfoque para descubrir el agente causal de una enfermedad es que ahora podemos identificar situaciones donde puede haber más de una causa.

Nuestro enfoque combina datos de secuenciación de DNA y RNA es completa y también demuestra que los resultados utilizando dos enfoques dieron resultados coherentes y confirmaron la presencia de dos virus relacionados. Empleó un procedimiento modificado para el aislamiento de Caulimovirus y produce una muestra que se enriquece para ácidos nucleicos de virus asociados y que estaban protegidos dentro de la cápside del virus. Un laboratorio de servicio fue contratado para llevar a cabo la secuenciación de ADN. El concepto esencial para la secuenciación de novo es que la ADN polimerasa incorpora el fluorescente con la etiqueta nucleotides en un filamento de la plantilla de ADN durante los ciclos secuenciales de la síntesis de ADN. Los contigs montado seguido por NGS se presentaron en un flujo de trabajo Bioinformático produciendo unos contigs que fueron identificados como virus contigs. Más confirmación de virus dos genomas10,24,48,49,50 se obtuvo a través de análisis Bioinformático de datos RNA-seq de preparaciones de RNA ribo-agotado. Un resultado interesante fue conocer que las poblaciones de secuencias recuperaron por secuenciación de ADN y ARN proporciona distribuciones similares de ácidos nucleicos virales y no virales. Para secuenciación de DNA y RNA, < 0,5% de secuencias fueron de origen del virus. Dentro de la población de virus secuencias 78-82% perteneció a la familia Caulimoviridae. Comparando los contigs de virus ensamblados de secuenciación de DNA y RNA, se confirmó que los dos genomas montados se produjeron en ambos conjuntos de datos.

Una preocupación de usar sola secuencia de la DNA para identificar los nuevos genomas de virus es que el genoma de badnavirus es un ADN circular abierto. Conjeturamos que secuencias de superposición de discontinuidades en el genoma pueden presentar obstáculos para el ensamblaje del genoma de contigs. Examen inicial de los resultados de la secuencia de la DNA reveló dos genomas de virus similares. Presumimos que estos genomas representaban o diversidad genética de una especie que no ha sido estudiada o mentionadas aquí dos especies co infectar la misma planta24. Por lo tanto, el análisis Bioinformático colectiva de conjuntos de datos obtenidos por NGS ADN y la secuencia de RNA, permitió la confirmación de la presencia de los dos genomas de longitud completa.

Hay otro informe que desarrolló un método alternativo para la extracción de ácidos nucleicos y VLP de homogenados de planta para los estudios de metagenómica, basados en procedimientos para recuperar el ADN del virus del mosaico del coliflor (CaMV; un caulimovirus)3. Este enfoque identifica novela RNA y secuencias de ADN de virus en plantas no cultivadas. Las medidas derivadas del procedimiento de aislamiento caulimovirus utilizado en este estudio para descubrir al agente causal de una enfermedad de las plantas cultivadas son los pasos para extraer VLP de plantas naturalmente infectadas24. El éxito de ambos métodos modificados sugiere que el procedimiento marco para caulimovirus aislamiento puede ser un valioso punto de partida para estudios de metagenómica de virus de plantas en general.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Investigación fue financiada por el centro de Oklahoma para el avance de la ciencia y la tecnología aplicada investigación programa fase II AR 132-053-2; y por el Departamento de Oklahoma de agricultura cultivos de especialidad de investigación programa de subvenciones. Agradecemos a Dr. HongJin Hwang y la instalación de base de Bioinformática de OSU que fue apoyado por becas del NSF (EOS-0132534) y NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 y 5P20RR15564-03).

Materials

NaH2PO4 Sigma-Aldrich St. Louis MO S5976 Grinding buffer for virus purification
Na2HPO4 Sigma-Aldrich  S0751 Grinding buffer for virus purification
Na2SO3 Thermo-Fisher Waltham, MA 28790 Grinding buffer for virus purification
urea Thermo-Fisher PB169-212 Homogenate extraction 
Triton X-100 Sigma-Aldrich  X-100 Homogenate extraction 
Cheesecloth VWR Radnor, PA 21910-107 Filter homogenate 
Tris  Thermo-Fisher BP152-5 Pellet resuspension& DNA resuspension buffers 
MgCl2 Spectrum, Gardena, CA M1035 Pellet resuspension buffer
EDTA Spectrum E1045 Stops enzyme reactions
Proteinase K Thermo-Fisher 25530 DNA resuspension buffer
phenol:chloroform:isoamylalcohol  Sigma-Aldrich P2069 Dissolve virion proteins
DNAse I Promega M6101 Degrade cellular DNA from extracts
95% ethanol Sigma-Aldrich 6B-100 Virus DNA precipitation
Laboratory blender VWR 58984-030 Grind leaf samples
Floor model ultracentrifuge  &Ti70 rotor Beckman Coulter, Irving TX  A94471 Separation of cellular extracts
Floor model centrifuge and JA-14 rotor Beckman Coulter  369001 Separation of cellular extracts
Magnetic stir plate VWR 75876-022 Mixing urea into samples overnight
Rubber policeman VWR 470104-462 Dissolve virus pellet
 2100 bioanalyzer Instrument Agilent Genomics, Santa Clare, CA G2939BA Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip 5067-1513 Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip 5067-4626 Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer
Nanodrop spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Plant total RNA isolation kit Sigma-Aldrich STRN50-1KT Isolate RNA for RNA-seq
RNase-free water  VWR 10128-514 Resuspension of DNA and RNA for NGS
RNA concentrator spin column Zymo Research, Irvine, CA R1013 Prepare RNA for RNA-seq
rRNA removal kit Illumina, San Diego, CA MRZPL116 Prepare RNA for RNA-seq
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Prepare RNA for RNA-seq
 RNA  enrichment system Roche 7277300001 Prepare RNA for RNA-seq
Agarose  Thermo-Fisher 16500100 Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Ethidium bromide Thermo-Fisher 15585011 Agarose gel staining
pGEM-T +JM109 competent cells Promega, Madison, WI A3610 Clone genome fragments
pFU Taq polymerase Promega M7741 PCR amplify virus genome
dNTPs Promega U1511 PCR amplify virus genome
PCR oligonucleotides IDT, Coralvill, IA Custom order PCR amplify virus genome
Miniprep DNA purification kit Promega A1330 Plasmid DNA purification prior to sequencing
PCR clean-up kit Promega A9281 Prepare PCR products for cloning
pDRAW32 software ACAClone Computer analysis of circular DNA and motifs
MEGA6.0 software MEGA Molecular evolutionary genetics analysis
Primer 3.0 Simgene.com
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit Thermo-Fisher R11490 Fluorometric determination of RNA quantity
GS Junior™ pyrosequencing System Roche 5526337001 Sequencing platform
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) Roche 5996520001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents Roche 5996490001 Reagents for emulsion PCR
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) Roche 5996538001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit Roche 5996511001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr Titanium Sequenicing kit* Roche 5996554001 Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit Roche 5996619001 Sequencing plate with associated reagents and gaskets
IKA Turrax mixer 3646000 Special mixer used with Turrax Tubes
IKA Turrax Tube (specialized mixer) 20003213 Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions
GS Nebulizers Kit Roche 5160570001 Nucleic acid size fractionator for use during library preparations
GS Junior emPCR Bead Counter Roche 05 996 635 001 Library bead counter
GS Junior Bead Deposition Device Roche 05 996 473 001 Holder for Picotiter plate during centrifugation
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices Roche 05 889 103 001 Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation
GS Junior Software Roche 05 996 643 001 Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Run Processor v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS De Novo Assembler v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Reference Mapper v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
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Verchot, J., Thapa, A., Wijayasekara, D., Hoyt, P. R. Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes. J. Vis. Exp. (137), e57855, doi:10.3791/57855 (2018).
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