JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57855
, , ,
1Texas A&M Agrilife Center at Dallas, 2Noble Research Center,Oklahoma State University, 3Department of Biology, College of Engineering and Natural Sciences,The University of Tulsa, 4Bioinformatics and Genomics Core Facility, Department of Biochemistry and Molecular Biology,Oklahoma State University

Summary

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Abstract

Deze benadering van de metagenome wordt gebruikt om plantenvirussen met circulaire DNA-genoom en hun afschriften te identificeren. Vaak plant DNA virussen die zich voordoen in lage titers in hun gastheer of niet mechanisch naar een andere host kunnen niet worden geënt zijn moeilijk te propageren om te bereiken van een grotere titer van besmettelijk materiaal. Besmette bladeren zijn grond in een milde buffer met een optimale pH en Ionische samenstelling aanbevolen voor het zuiveren van de meeste bacilliform Para retrovirussen. Ureum wordt gebruikt te breken integratie-organen die val virionen en te ontbinden van cellulaire componenten. Differentiële centrifugeren biedt verdere scheiding van virionen van verontreinigingen van de plant. Proteïnase K behandeling verwijdert vervolgens de capsids. Dan is de virale DNA geconcentreerd en gebruikt voor het rangschikken van de volgende generatie (NGS). De NGS-gegevens worden gebruikt voor het monteren van contigs die zijn voorgelegd aan NCBI-BLASTn te identificeren van een subset van virus sequenties in de gegenereerde dataset. In een parallelle pijpleiding is RNA geïsoleerd van besmette bladeren met behulp van een standaard kolom gebaseerde RNA extractiemethode. Vervolgens wordt ribosoom uitputting uitgevoerd om te verrijken voor een subset van mRNA en virus afschriften. Geassembleerde sequenties afgeleid van RNA sequencing (RNA-seq) werden voorgelegd aan NCBI-BLASTn te identificeren van een subset van virus sequenties in deze dataset. In onze studie vastgesteld we twee verwante full-length badnavirus genomen in de twee datasets. Deze methode verdient de voorkeur aan een andere gemeenschappelijke benadering die extracten van de totale bevolking van kleine RNA opeenvolgingen te reconstrueren plant virus genomic opeenvolgingen. Dit laatste metagenomic pijpleiding herstelt virus gerelateerde sequenties die zijn retro-transcriberen elementen ingevoegd in het genoom van de plant. Dit is gekoppeld aan biochemische of moleculaire testen verder onderscheiden de actief infectieuze agentia. De aanpak die is beschreven in deze studie, herstelt sequenties die representatief is voor het repliceren van virussen die waarschijnlijk actieve virusinfectie geven.

Introduction

Opkomende plantenziektes rijden onderzoekers aan het ontwikkelen van nieuwe instrumenten voor het identificeren van de juiste causale agent(en). Eerste verslagen van nieuwe of terugkerende virusziekten zijn gebaseerd op algemeen voorkomende symptomen zoals mozaïek en misvormingen van het blad ader wissen, dwerggroei, verwelking, laesies, necrose of andere symptomen. De norm voor het melden van een nieuw virus, zoals het oorzakelijke agens voor een ziekte wil scheiden van andere contaminerende pathogenen, propageren het in geschikte host en reproduceren van de ziekte door het enten in gezonde planten van de oorspronkelijke host-soorten. De beperking in deze benadering is dat vele geslachten van plantenvirussen afhankelijk is van een insect of andere vectoren voor verzending naar een geschikte gastheer of terug naar de oorspronkelijke host-soorten. In dit geval, het zoeken naar de geschikte vector kan worden verlengd, kunnen er problemen om laboratorium kolonies van de vector en verdere inspanningen zijn nodig om het opstellen van een protocol voor experimentele transmissie. Als de voorwaarden voor succesvolle laboratoriumonderzoek naar de overdracht kunnen niet worden bereikt, dan achterblijft het werk bij de standaard voor het melden van een nieuwe virus van de ziekte. Voor virussen die zich in hun natuurlijke gastheren op zeer lage titers voordoen, moeten onderzoekers vaststellen alternatieve hosts teeltmateriaal te handhaven voldoende besmettelijke voorraden voor het uitvoeren van onderzoek. Voor soorten van het virus die alleen een paar planten infecteren kunnen dit ook een belemmering voor de teelt van voorraadculturen1.

In de afgelopen jaren wetenschappers zijn vaker in dienst van high-throughput NGS en metagenomic benaderingen te ontdekken virus sequenties die aanwezig zijn in de omgeving, die niets te maken met een bekende ziekte kan bestaan, maar kan worden toegewezen aan taxonomische soorten en geslachten 2 , 3 , 4. dergelijke benaderingen van de ontdekking en de categorisering van genetische materialen in een aparte omgeving bieden een manier om diversiteit van het virus in de natuur of hun aanwezigheid in een bepaalde ecosysteem te beschrijven, maar niet noodzakelijkerwijs bevestigt aan een kader voor het definiëren van causale agenten voor een schijnbare ziekte.

Het geslacht Badnavirus behoort tot de familie Caulimoviridae van pararetroviruses. Deze virussen zijn bacilliform in vorm met circulaire dubbele streng DNA-genoom van ongeveer 7 tot en met 9 kb. Alle pararetroviruses worden gerepliceerd via een RNA-intermediair. Pararetroviruses bestaan als episomes en onafhankelijk van de plant chromosomale DNA5,6repliceren. Veldstudies van virus bevolking erop wijzen dat deze virus populaties genetisch complex. Informatie verkregen in een heel scala van plant genomen door hoge doorvoer sequentiebepaling hebben bovendien talrijke voorbeelden van badnavirus genoom fragmenten ingevoegd plant genomen door onwettige integratie gebeurtenissen ontdekt. Deze endogene badnavirus sequenties zijn niet noodzakelijkerwijs geassocieerd met infectie7,8,9,10,11. Vervolgens het gebruik van NGS om nieuwe badnaviruses als het oorzakelijke agens van de ziekte wordt bemoeilijkt door de diversiteit van de populaties van episomal genomen, alsmede het voorkomen van endogene sequenties12,13.

Hoewel er niet een optimale pijpleiding voor de ontdekking van roman pararetrovirus genomen, zijn er twee gemeenschappelijke benaderingen om te identificeren deze virussen als causaal agenten voor ziekte. Een methode is om te verrijken voor kleine RNA-sequenties van besmette bladeren en vervolgens monteren deze sequenties te reconstrueren van het virus genome(s)14,15,16,17. Een andere benadering is de rollende cirkel versterking (RCA)-naar het versterken van de circulaire DNA-virus genoom18. Het succes van RCA, is afhankelijk van de leeftijd van het blad en de titer van het virus in het geselecteerde weefsel. De RCA-producten zijn onderworpen aan beperkingsspijsvertering en gekloond in plasmiden voor directe sequencing2120,19,.

Canna geel mottle virus (CaYMV) is een badnavirus en wordt beschreven als de etiologische oorzaak van gele mottle ziekte in canna, hoewel slechts een 565 bp fragment van het genoom eerder geïsoleerd zijn van besmette cannas22 is. Een hedendaagse studie is gebleken dat CaYMV in Alpinia purpurata (bloeiende gember; CaYMV-Ap)23. Het doel van deze studie was om te herstellen van volledige badnavirus genoom sequenties van besmette canna lelies. We beschrijven een protocol voor het zuiveren van virus vanuit plant verontreinigingen, en vervolgens isoleren viraal DNA van deze voorbereiding, en bereiden een DNA-bibliotheek voor gebruik in NGS. Deze benadering elimineert de noodzaak voor de tussenliggende moleculaire amplificatie stappen. Wij isoleren ook mRNA van geïnfecteerde planten voor RNA-seq. NGS, waarin RNA-seq werd uitgevoerd met behulp van elk preparaat van nucleic zuur. Geassembleerde contigs bleken te relateren aan het Badnavirus taxon in beide datasets met behulp van het nationaal centrum voor biotechnologie en informatie (NCBI) de zoekfunctie van fundamentele lokale uitlijning voor nucleic zuren (BLASTn). We geconstateerd dat het genoom van twee badnavirus soorten24.

Protocol

1. algemene Virus zuivering door differentiële centrifugeren standaardmethode via Covey et al. 25 Eerst, gesneden van 80-100 g van bladeren van zieke planten en vermalen in een waring blender bij 4 ° C met behulp van 200 mL buffer slijpen (0.5 M NaH2PO4, 0.5 M Na2HPO4 (pH 7,2). en 0,5% (w/v) nb2SO3). Draag een laboratorium jas en handschoenen voor alle stappen van deze procedure. Breng het homogenaat (300 mL) in een bekerglas van 1,0 L. 18 g ureum en 25 mL 10% nonionic wasmiddel (t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)9OH) toevoegen aan het homogenaat binnen een chemische kap.Opmerking: Voor deze stap is het beste te dragen van veiligheidsbril en een eenvoudige ademhaling masker voor persoonlijke bescherming. Roer met een magneetroerder kort in de kap en dek het bekerglas af met de folie. Vervolgens het bekerglas folie bedekt overbrengen in een koude kamer en roer met een magneetroerder ‘s nachts bij 4 ° C. Overdracht van het homogenaat te centrifugeren rotor flessen (250 mL containers) en centrifuge in de rotor van een vaste hoek bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. In een chemische zuurkast, herstellen van de bovendrijvende substantie en filter door 4 lagen van kaasdoek. Verdeel het homogenaat onder 38.5 mL polypropyleen centrifuge buizen en centrifuge voor 2,5 h bij 40.000 x g bij 4 ° C. Typisch, controleren op de aanwezigheid van een groene pellet aan de onderkant van de buis en een witte pellet langs de lengte van de buis. Giet af het supernatant en behouden van beide pellets; Leg monsters op ijs.Opmerking: De groene pellet bevat chloroplasten, zetmeel en andere organellen. Werken in een chemische kap, gebruik een rubber politieagent te scheiden van de pellets. Resuspendeer de witte pellet in elke fles van de rotor in 1 mL ddH2O in de loop van 1-2 h terwijl het handhaven van dat de schorsingen overnacht bij 4 ° C om de materialen te volledig ontbinden in oplossing. Centrifugeer de schorsing op 6.000 x g en bij 4 ° C gedurende 10 minuten te verwijderen van de resterende puin. Centrifugeer de geconcentreerde schorsing bij 136.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C tot virionen pellet. Resuspendeer de pellets in 1 mL buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2).Opmerking: Een optionele stap is voor de behandeling van virionen met DNAse ik (10 µg/mL) gedurende 10 minuten bij 37 ° C voor het verwijderen van niet-encapsidated DNA, dat wil zeggen, besmetten chloroplast en mitochondriaal DNA. Vervolgens de inactivering van de DNAse ik door toevoeging van EDTA tot 1 mM. Verstoren virionen met 40 µL van 2 µg/µL proteïnase K bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Werken binnen een chemische kap virion DNA herstellen door organische extractie. Draag handschoenen, een gelaatsscherm en een laboratorium jas tijdens de extractie voor bescherming tegen potentiële acute gezondheidseffecten. 1 deel van fenol-chloroform-Isoamylalcohol (49:50:1) Voeg aan het monster en schudden met de hand voor 20 s. Centrifuge bij kamertemperatuur voor 5 min op 16.000 x g. verwijderen de bovenste waterfase en overdracht aan een nieuwe buis. Herhaal deze extractie tweemaal of vaker. Vervreemding van de organische fase door deze te plaatsen in een afval fles voor goede institutionele chemische verwijdering26. Het concentreren van het DNA met behulp van ethanol neerslag. Gebruik van 0,3 M eindconcentratie van natriumacetaat (pH 5.2) en 2,5 volumes van 95% ethanol. Leg monsters bij-20 ° C gedurende 30-60 min en centrifuge bij 13.000 x g gedurende 10-20 min naar de DNA26pellet. Werken bij de Bank van een laboratorium, resuspendeer de pellet DNA in 1 mL 0,1 mM TE buffer (pH 8.0). Filer de schorsing door een commerciële gel filtratie kolom (normaal gebruikt voor de Kettingreactie van de polymerase (PCR) opruimen) te elimineren zouten en lage moleculaire gewicht materiaal dat NGS kan belemmeren. Analyseer de monsters door 1% agarose gelelektroforese gebruik van ethidiumbromide kleuring om weer te geven van de kwaliteit van de voorbereidingen. De kwaliteit van DNA met een spectrofotometer nanodrop beoordelen.Opmerking: Een verhouding van monster absorptie bij 260 λ en 280 λ tussen 1,85 en 2.0 geeft meestal aan dat de voorbereiding “schone” van verontreinigingen en van de gewenste kwaliteit. Analyseren van de kwaliteit van DNA (gebruik 5 pg tot en met 10 ng) met behulp van een chip gebaseerd capillaire elektroforese instrument.Opmerking: Kwaliteit output toont schone pieken, vertegenwoordigen de fragmenten van DNA die door grootte langs een x-as verdeeld. Piekhoogte geeft overvloed van het fragment. Grillige pieken geven gedeeltelijk aangetaste fragmenten of chemische contaminanten. Ronde curven vertegenwoordigen een uitstrijkje van DNA die aangeeft van slechte kwaliteit 2. bibliotheek voorbereiding met DNA en emulsie gebaseerde klonen versterking (emPCR amplificatie) Opmerking: De bibliotheek is meestal bereid door een NGS-faciliteit die klantgericht werk verricht. Schuintrekken van een oplossing van DNA (> 200 ng) met behulp van een vernevelaar die het DNA wordt omgezet in fragmenten. De commerciële adapters volgens de handleiding van instructies27afbinden. Verrichten emPCR versterking van het DNA-monster volgens de fabrikant instructies28,29,30. Herhaal de stap van wassen drie keer, en na elke wasbeurt, pellet de kralen in een minicentrifuge voor 10 s. negeren het supernatans dat na elke wasbeurt.Opmerking: De procedure begint met de voorbereiding van de parels van de vangst door het wassen in de commerciële wassen-buffer die bij de kit geleverd. emPCR wordt meestal gebruikt voor de versterking van de sjabloon voor NGS. Warmte denatureren de DNA of RNA bij 95 ° C voor 2 min en dan 4 ° C tot klaar voor gebruik. Gebruik 200 miljoen moleculen van DNA/RNA naar 5 miljoen vangen kralen in een eindvolume van 30 µL. bereiden een mock monster naast het DNA/RNA monster en voert u de volgende stappen met het nucleïnezuur monster evenals de mock monster. Uitvoeren van membraanemulsificatie door vortexing de buis van olie-emulsie voor 10 s ter maximum-vaart, giet de hele inhoud (4 mL) in een plastic buis die compatibel is met een platform-homogenizer roeren. Plaats de opzwepende buis op het platform te mengen de emulsie van 2.000 toeren per minuut gedurende 5 minuten. Afzien 100 µL aliquots van emulsie in 8-strip cap buizen of in een 96-wells-plaat. Cap de buizen of verzegelen van de plaat en uitvoeren van emPCR met behulp van de fabrikant geadviseerde programma28.Opmerking: Nadat de PCR voltooid is, controleert u de putten om te zien of de emulsie intact is en gaat u verder. De hele put negeren als de emulsie gebroken is. Draag een laboratoriumjas en werken in een chemische kap voor het verzamelen van de versterkte DNA kralen (ADB). Vacuüm gecombineerd de emulsie van de putten en verzamelen de kralen in een tube van 50 mL. Spoel de putjes tweemaal met 100 µL van isopropanol en gecombineerd de spoelen aan de dezelfde 50 mL-buis. Vortex de verzamelde emulsies en resuspendeer de ADB met isopropanol tot een eindvolume van 35 mL. Pellet de ADB bij 930 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg 10 mL buffer te verbeteren. Vortex de ADB en daarna wassen door toevoeging van isopropanol aan 40 mL eindvolume Centrifuge en negeren het supernatant na elk wassen en herhaal de wash-stap tweemaal. Verrichten van een definitieve wassen met behulp van ethanol in plaats van isopropanol. Voeg buffer 35 mL eindvolume, vortex en pellet verbeteren de kralen bij 930 x g gedurende 5 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen maar laat 2 mL buffer te verbeteren. Spoel de suspensie tot een koker microcentrifuge en kort centrifugeren om de ADB pellet. Spoel na het supernatant teruggooi, de ADB pellet tweemaal met 1 mL van de buffer. Centrifugeren en verwijder het supernatant na elke wasbeurt. Voeg 1 mL 1 N NaOH tot de kralen ter voorbereiding van de DNA bibliotheek kraal verrijking. Vortex de ADB en vervolgens Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeren en verwijder het supernatant. Deze wassen stap eenmaal herhaald. Voeg 1 mL onthardende buffer, vervolgens de ADB vortex en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Kort centrifugeren en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap opnieuw met behulp van 100 µL van onthardende buffer. Toevoegen om te ontharden sequencing inleidingen tot het DNA, 15 µL van Seq Primer A en 15 µL van Seq Primer B geleverd in de kit. Kort Meng door vortexing en plaats de microcentrifuge buis in een blok van warmte bij 65 ° C gedurende 5 min. overdracht aan ijs gedurende 2 minuten. Spoel driemaal met 1,0 mL buffer gloeien. Vortex voor 5 s en negeren het supernatant telkens. Voordat sequencing, meet het aantal kralen met behulp van een commerciële kraal counter. Er moet ten minste 500.000 verrijkt kralen.Opmerking: De teller van de parel is een speciaal apparaat dat de maatregelen van de kralen in een meegeleverde microcentrifuge buis. 3. algemene mRNA isolatie en synthese beginnen met besmet Canna verlaat die testen door RT-PCR voor met behulp van CaYMV gemeld diagnostische Primers dsDNA Draag een laboratorium jas en latex handschoenen voor persoonlijke bescherming in alle opeenvolgende stappen. Werken bij de Bank van een laboratorium, verzamelen van 12 monsters uit de bladeren en de monsters duik in vloeibare stikstof. Gebruik een kraal molen voor homogenisering. Gebruik een commerciële kit waarmee een standaard kolom gebaseerde methode voor totale plant RNA isolatie. Toevoegen van de lysis-buffermengsel van guanidine-isothiocyanaat, verzorgd door de kit om de gemalen monster hermetisch en schud voor 20 s. Toevoegen van ethanol en meng, volgens de instructies van de kit. Elke homogenaat toevoegen aan een kolom van de spin die RNA aan het membraan bindt. Spoel driemaal en elueer de RNA in een herstel buis24. Het gebruik van een spectrofotometer voor het meten van de verhouding tussen de absorptie bij 260 λ en 280 λ. bevestigen RNA integriteit met behulp van 1% agarose gelelektroforese gekleurd met ethidiumbromide RNA te kwantificeren.Opmerking: Een Extinctieverhouding tussen 1,85 en 2.0 geeft aan dat de voorbereiding van de gewenste kwaliteit. Behandelen van RNA met DNase ik (10 µg/mL) gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Gebruik een commerciële spin kolom te concentreren van RNA in RNase-gratis water31. Zwembad RNA monsters voordat u verdergaat. Gebruik een rRNA verwijdering kit te verwijderen van de plant ribosomaal RNA. Aliquot magnetische kralen aan de microcentrifuge buis en twee keer wassen water met RNase-gratis. Vortex de buis aliquoot aan resuspendeer, plaats de buis op een magnetische staan en wacht tot vloeistof om te wissen. Verwijder het supernatant en vervangen door de magnetische kraal resuspensie oplossing. Vortex resuspendeer en voeg 1 µL van RNase-remmer.Opmerking: Deze kits gebruiken oligo-dT gebonden aan magnetische kralen die om mRNA te vermengen. De methode gebruikt standaard magneet kraal scheidingstechnologie om te herstellen van afschriften24. Combineer 500 ng tot 1,25 µg van RNA, RNase-gratis water en reactie buffers geboden door de kit. Plaats het mengsel gedurende 10 minuten bij 50 ° C. Verwijder uit hitte en voeg gewassen magnetische kralen in RNAse gratis water. Vortex kort en reeks bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Plaats op een magnetische staan en wacht tot de vloeistof om te wissen. Het supernatant overbrengen in een verse microcentrifuge buis. Ingesteld op ijs. Gebruik een oplossingsgerichte vangen methode voor verrijking van exosomes en 200 ng van RNA te bereiden de cDNA Bibliotheek.Opmerking: De dubbele streng cDNA Bibliotheek wordt meestal bereid door een NGS-faciliteit die klantgericht werk verricht. Fragment van het RNA met behulp van een commerciële RNA fragmentatie oplossing (0.136 g ZnCl2 en 100 mM Tris-HCl pH 7.0). Voeg 2 µL van oplossing aan 18 µL van RNA (200 ng totaal). Spin buizen kort in de microcentrifuge, leg de monsters bij 70 ° C gedurende 30 s, en overdracht aan ijs. Stop de reactie met behulp van 2 µL van 0.5 M EDTA pH 8.0 en 28 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. RNA aan magnetische kralen door het mengen van bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten gebruik een magnetische concentrator te verzamelen van de kralen en verwijder het supernatant binden. Wassen van de kralen driemaal met 200 µL van 70% ethanol. Discard elk wassen en dan lucht droog resuspendeer de Ingehuld kralen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten in 19 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. Anneal willekeurige inleidingen te gefragmenteerde RNA door te verwarmen tot 70 ° C gedurende 10 minuten en plaats vervolgens de buis op ijs voor 2 min. voorbereiden de eerste strand en tweede onderdeel cDNA met behulp van een standaard commerciële cDNA synthese kit. Tweepersoonskamer-strand cDNA met behulp van een magnetische kraal concentrator zuiveren. Spoel met 800 µL van 70% ethanol driemaal. Discard elk wassen en droge lucht resuspendeer de pellets bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten in 16 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. Gebruik de magnetische kraal concentrator te scheiden van de parels van de double-stranded cDNA, die nu in oplossing. Verwijder de cDNA door pipetteren in een nieuwe 200 µL PCR buis. Fragment einde reparatie met behulp van Taq polymerase en een mengsel van deoxyribonucleotides geboden door een commerciële bibliotheek voorbereiding kit uitvoeren. De commerciële kit biedt vooraf verdunde adapters toevoegen aan elk uiteinde van de dubbel-strand cDNA met behulp van commerciële ligase bij 25 ° C gedurende 10 minuten. 4. NGS van DNA bibliotheek bereid uit ruwe Virus voorbereiding en dsDNA bibliotheek bereid uit mRNA Gebruik van een standaard hoge-doorvoer pyrosequencing instrument en volg alle aanbevolen fabrikanten protocollen voor het genereren van directe uitlezingen van opeenvolgingen van DNA. Gebruik commerciële sequencing reagentia, met inbegrip van fluorescently geëtiketteerde nucleotiden.Opmerking: Voor details refereer instructies van de fabrikant van het instrument is voorzien. Verrichten na sequentie-analyse met behulp van genoom vergadering software die automatisch leest assembleert voor de productie van de eerste reeks van contigs met een gemiddelde lengte van < 700 bp. het gebruik van de software van de FastQC op de iPlant/CyVerse-website die voert kwaliteitscontrole controles op de ruwe reeks gegevens32. Selecteer sequenties met Phred scores ≥ 30 te blijven langere sequenties van kleinere volgorde leest24 -met behulp van mapping en amplicon software te reconstrueren.Opmerking: Voor details refereer instructie van de fabrikant. Dienen deze geassembleerde contigs aan NCBI-BLASTn-analyse met behulp van MEGABLAST standaard module evenals Viridplantae (TaxID: 33090) en virussen (TaxID: 10239) zoals de beperking van organisch33 namen. Verzamel de subpopulatie van contigs die hoge gelijkenis met gerapporteerde Badnavirus genomen in een rapport tonen. Controleer of dat de gekoppelde steigers waarmee een of meer kandidaat-full-length virus genoom, correct in-framereeksen die hebben dezelfde organisatie als de standaard badnavirus genoom produceren. Om dit te doen, kunt u het kandidaat-volledige lengte virusgenoom ingevoerd door een plasmide tekening software. Bevestig de eerste 15 nucleotiden bestaat uit een tRNAvoldaan (TGGTATCAGAGCGAG) die is zeer bewaard onder badnaviruses. Zoek het potentiële polyadenylatie signaal in de buurt van het einde 3’ van het genoom. Aantekeningen van het volledige genoom ter identificatie van de aanwezigheid van twee kleine ORFs en één grote ORF codering van een polyprotein. Dan gebruik de ExPASy portal vertalen instrument om te identificeren van de badnavirus ORF3, ORF1 en ORF2 vertaling producten34.Opmerking: Deze wetenschappelijke software is gratis en zal genereren circulaire DNA, het identificeren van alle geopende lezing frames en biedt een directe uitvoer om te controleren dat de volgorde de volledige lengte circulaire DNA-genoom vertegenwoordigt. Gebruik open bron meerdere reeks bestandsvergelijkingsprogramma’s, spier- en CLUSTALW, om te vergelijken het virus genoom verkregen DNA en RNA analyses35,36. Zoeken in de database van de nucleotide NCBI voor het verkrijgen van het volledige genoom sequenties van 30 badnavirus soorten en ze te exporteren als een document in .fasta formaat. Sequenties te uploaden naar een software die voert van de evolutionaire genetische analyse van reeksen samen met de virus genoom sequenties verkregen door NGS. Genereren meerdere reeks aanpassingen en Maximum waarschijnlijkheid bomen met behulp van spier37. 5. beoordeling van DOVO Sequencing door PCR versterking van het genoom van het Virus uit besmette planten Voer de nieuw vastgestelde full-length badnavirus genoom sequenties (.fasta formaat) in de gratis online Primer3 tool voor het afleiden van PCR inleidingen38. Primer sets die gespreide producten van 1.000-1.500 bp langs de gehele lengte van de genome(s) van het virus produceren zal te identificeren. De sequenties verzenden een servicepunt die zullen synthetiseren en leveren van PCR inleidingen.Opmerking: De uitvoer identificeert aanvaardbaar primerparen met gemeenschappelijke en aanvaardbaar smeltende temperaturen en precieze primer locaties langs de sequenties die zijn geïntroduceerd. Werken bij een bank laboratorium en het dragen van een lab-jas en handschoenen, isoleren 5 µg DNA uit de bladeren van de virus-geïnfecteerde en gezonde controle met behulp van een geautomatiseerde methode waarbij standaard paramagnetisch cellulose deeltjes DNA plant materiaal €39 isoleren. Bevriezen van blad materiaal (20-40 mg) in vloeibare stikstof in een microcentrifuge buis en grind met behulp van een kraal molen. Combineer het monster met lysis-buffermengsel in een microcentrifuge buis en RNase A toevoegen aan elk monster. Vortex het monster voor 10-20 s en kort draaien aan het verwijderen van vaste deeltjes monster.Opmerking: Paramagnetisch cellulose deeltjes hebben hoge DNA-bindende capaciteit en hoge opbrengst van pure DNA te isoleren. De standaard commerciële silica kolom methoden voor DNA isolatie efficiënt niet uitgepakt van DNA uit een grote verscheidenheid van plantensoorten. Tientallen van methoden bestaan dus, dat modificaties van deze procedures zijn ter verbetering van de efficiëntie voor individuele plantensoorten. De geautomatiseerde paramagnetisch cellulose deeltje methode werd gekozen omdat het DNA van meer en hogere kwaliteit meer dan 25 soorten kruidachtige angiosperm €40 levert. Gebruik commerciële reagens cartridges voor geautomatiseerde paramagnetisch DNA-isolatie. 300 µL van nuclease gratis water toevoegen aan elke commerciële reagens cartridge en overdracht plant lysate aan het zelfde patroon. Plaats de cartridge in de cartridge rek, plaats van een plunjer in de put dichtst aan de elutie buis, en plaats elutie buffer in de elutie buis. Laden cartridges in de geautomatiseerde nucleïnezuur isolatie machine en uitvoeren van de plant DNA isolatie protocol41,42. PCR voor het afleiden van een aantal overlappende PCR producten uitvoeren. 5 µM voor elke voorwaartse en omgekeerde primer met 35 cycli van PCR versterking gebruiken. De volgende fietsen gebruiksvoorwaarden: denaturatie bij 95 ° C gedurende 60 s, gloeien bij 50 ° C voor 45 s, en de uitbreiding bij 72 ° C gedurende 1-2 minuten met een definitieve verlenging bij 72 ° C voor 7-10 min. gebruik een voorverpakte gel filtratie kolom te elimineren zouten en lage moleculaire gewicht materiaal als in stap 1.231. Berekenen van een verhouding 3:1 molair van PCR product op vector om te bepalen van de hoeveelheid PCR product afbinden tot 50 ng van gelineariseerde pGEM plasmide43. Gebruik een besturingselement invoegen DNA om te bepalen of de ligations efficiënt werken. Uitvoeren van de afbinding ‘s nachts met behulp van T4 DNA ligase (3 U/µL) bij 4 ° C. Vervolgens transformatie commercieel bereid JM109 bevoegde Escherichia coli cellen. Gebruik controle 100 pg van Onbesneden plasmide DNA als positieve controle voor efficiënte transformatie. Plaat 100 µL van getransformeerde cellen op LB-agar platen met antibiotica en blauw/wit selectie herstellen ligaturen plasmiden26. Incubeer de platen gedurende 16-24 uur bij 37 ° C.Opmerking: De vector pGEM heeft een lacZ-gen die β-galactosidase codeert. Getransformeerde bacteriën gegroeid op een bord zal met 100 µg/mL ampicilline, 0.5 mM IPTG, 80 µg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) veranderen blauwe vanwege β-galactosidase-activiteit. Het plasmide pGEM is gelineariseerde op een wijze die het lacZ gen verstoort. Koloniën die de PCR product inserts bevatten verstoren de lacZ gen en X-gal niet doen metaboliseren. Deze kolonies zijn wit. Dus kunnen kolonies met een insert worden onderscheiden van degenen zonder een invoegen door de kleur van de kolonie (wit versus blauw)26. Isoleren van DNA van drie kolonies met behulp van een standaard kolom gebaseerde plasmide isolatie kit39. Volgorde van drie plasmiden van transformatie product. Elke opeenvolging van DNA te vergelijken met het genoom van DOVO geassembleerd virus geproduceerd door NGS. Gebruik CLUSTALW uitlijnen van de sequenties en om ervoor te zorgen dat zij op passende wijze zijn besteld.

Representative Results

Deze gewijzigde virus zuivering methode verstrekt een verrijking van virus ANI’s nuttig zijn voor de identificatie van de twee soorten van het virus door NGS en bio-informatica. Na het homogenaat was gecentrifugeerd bij 40.000 x g gedurende 2,5 h, was er een groene pellet aan de onderkant van de buis en een witte pellet over de lengte. De groene pellet was geresuspendeerde in één buis van de microcentrifuge en de witte pellet was geresuspendeerde in twee microcentrifuge-buizen. PCR werd uitgevoerd met behulp van standaard CaYMV PCR diagnostische primers en producten werden ontdekt in de ontbindend witte pellet en niet de groene pellet(Figuur 1). Een monster van het ruwe preparaat werd onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie en we waargenomen bacilliform deeltjes meten 124-133 nm lengte (Figuur 1B). Dit is de voorspelde modale lengte van de meeste badnaviruses. DNA werd gewonnen uit de witte en groene korrels en geresuspendeerde afzonderlijk. In Figuur 1C, hebben we geladen 5 µL van DNA geëxtraheerd uit de groene en witte pellet monster (1.6 µg van DNA voor de groene fractie) en 3.1 µg van DNA voor de witte breuk naar 0,8% agarose gel elektroforese en geanalyseerd het DNA na ethidiumbromide kleuring. De groene fractie bevatte laag molecuulgewicht DNA, overwegende dat de witte breuk geproduceerd twee bands van hoger molecuulgewicht DNA, evenals het lager molecuulgewicht DNA (Figuur 1C). De gel gepresenteerd in Figuur 1C was 40 min lopen bij 100 V en de uitstrijkjes in lane 3 suggereert dat de gel spanning moet worden verlaagd tot duidelijker bands. Deze gegevens duiden erop dat de witte pellet voor virionen werd verrijkt. De DNA (0,6 µg/mL) concentratie uit het witte monster geëxtraheerd was laag, maar geschikt voor NGS, waarvoor een minimum van 10 ng van DNA om verder te gaan. De ANI van de gefragmenteerde werden gebruikt voor het bereiden van een bibliotheek voor NGS. Parallel, werd RNA gewonnen uit planten van de besmette canna (Figuur 1D) voor high-throughput RNA-seq. Een standaard workflow werd uitgevoerd voor de voorbereiding van de bibliotheek, NGS, contigs maken, en het identificeren van virale genoom sequenties (Figuur 1E). De uitvoerresultaten van het gebruik van DNA en RNA als grondstof werden vergeleken. Wij verkregen 188,626 ruwe DNA leest door NGS met behulp van DNA van ruwe virus voorbereiding werd geïsoleerd. Leest werden geassembleerd in 13,269 contigs en BLASTn werd gebruikt om te zoeken van de NCBI dataset van nucleotidesequenties (met behulp van Viridplantae TaxID: 33090 en TaxID van het Virus: 10239 als de beperkende organismen) (Figuur 1E). De resultaten van de NCBI-BLASTn bleek dat 93% van DOVO gemonteerd contigs cellulaire sequenties, 22% onbekend waren, en 0,3% virus contigs(Figuur 2). De meerderheid van de contigs die zijn gecategoriseerd als cellulaire sequenties werden geïdentificeerd als mitochondriale of chloroplast DNA. Binnen de dataset van virus contigs, 32% van de contigs virus verwant waren voor leden van Caulimoviridae (die waren niet Badnavirus sequenties) en 58% van deze hadden betrekking op Badnavirus. Van de contigs van het virus, 29% waren zeer soortgelijk e < 1 x 10-30CaYMV isoleren V17 ORF3 gen (EF189148.1), suikerriet bacilliform virus isoleren Batavia D, compleet genoom (FJ439817.1), en Banana streak CA virus een compleet genoom ( KJ013511). Binnen deze populatie waren er lange contigs die leek op twee volle lengte genomen. High-throughput RNA-seq geproduceerd 153,488 schoongemaakte individuele volgorde leest met een gemiddelde lengte van < 500 bp. aanliggend vergadering lees verminderd dit tot 8,243 contigs. Deze zijn voorgelegd aan NCBI-BLASTn (met behulp van Viridplantae TaxID: 33090 en TaxID van het Virus: 10239 als de beperkende organismen) en de uitgangen 76% van de contigs in een categorie van plant cellulaire sequenties, 23% geplaatst waren onbekend en 0,1% werden gecategoriseerd als (contigs) virus Figuur 2 B). nader onderzoek van de bevolking van de 0,1% van de bevolking van virus contigs bepaald dat 68% van deze werden toegewezen aan Caulimoviridae (Figuur 2B). Drie grote contigs binnen deze populatie werden geïdentificeerd met hoge gelijkenis (e < 1 X 10-30) te CaYMV isoleren V17 ORF3 gen (EF189148.1), suikerriet bacilliform virus isoleren Batavia D, compleet genoom (FJ439817.1) en banaan streep CA virus compleet genoom (KJ013511). Behandeling van de drie contigs, wij handmatig sloot zich aan bij twee van deze voor de productie van een full-length virusgenoom. We vergeleken de virus genoom lengte contigs geproduceerd door DNA en RNA sequencing als een wederzijdse steiger ter bevestiging van de aanwezigheid van twee full-length virus genomen. Een full-length virusgenoom voor 6,966 bp heette voorlopig Canna geel mottle associated virus 1 (CaYMAV-1) (Figuur 3A). Het tweede genoom was 7,385 bp en een variant van CaYMV infecteren Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Figuur 3A). Ten slotte, PCR inleidingen die werden ontworpen om kloon ~ 1000 bp fragment van elk virus, werden gebruikt om het differentieel detecteren beide genomen in een populatie van 227 canna planten negen commerciële rassen vertegenwoordigen. In veel gevallen waren afzonderlijke fabrieken geïnfecteerd met beide virussen. Wij bieden een voorbeeld van de RT-PCR detectie van CaYMAV-1 en CaYMV-Ap01 in de 12 planten. Drie van deze waren positief alleen voor CaYMV-Ap01 en negen waren positief voor beide virussen (Figuur 3B). Figuur 1 : Virus nucleïnezuur preparaten en NGS workflow. (A) Agarose (1,0%) gel elektroforese van 565 bp PCR fragmenten van CaYMV genomen. Twee PCR producten werden ontdekt in de monsters die zijn bereid uit de witte pellet (banen 1, 2) maar niet in het groene pellet monster (lane 3). Positieve controle (+) vertegenwoordigt een PCR product versterkt uit besmette plant DNA dat werd geïsoleerd met behulp van een geautomatiseerde methode waarbij standaard paramagnetisch cellulose deeltjes. Lane L bevat de DNA-ladder gebruikt als een standaard voor het meten van de omvang van lineaire DNA bands in monster rijstroken. (B) voorbeeld van virus deeltje bekeken door Transmissie Electronenmicroscopie in de witte pellet hersteld door ruwe fractionering van besmette canna bladeren. (C) Agarose (0,8%) gel elektroforese van DNA hersteld van de green (lane 1) en wit (lane 2) pellets dat getest positief met PCR in deelvenster A. De rode en gele stippen naast lane 2 identificeren twee ultrahoog moleculair gewicht DNA bands die in de witte breuk optreden. (D) Agarose (1%) gel elektroforese van totale RNA hersteld door kolom gebaseerde RNA zuivering. Lane L bevat de DNA-ladder gebruikt als een standaard voor het meten van de omvang van lineaire bands in monster rijstroken. Lane 1-6 bevat RNA van besmette canna blaadjes die werden samengevoegd tot één sample voor ribo-uitputting en RNA-seq. (E) Schematische pijpleiding van nucleïnezuur isolatie, bibliotheek voorbereiding sequencing, aanliggend vergadering en virusgenoom geïsoleerd ontdekking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Kroon grafieken visualiseren van de taxonomische categorieën contigs. (A) de grafiek op de linkerkant toont de overvloed en taxonomische distributie van contigs samengesteld uit de ruwe virus voorbereiding. De juiste grafiek ziet u de verhoudingen van virus contigs gekoppeld aan de Caulimoviridae familie, Badnavirus geslacht en drie nauw verwante soorten. (B) het paneel aan de linkerkant toont de overvloed van contigs afgeleid van RNA-seq gebaseerd op hun taxonomische distributie. Aan de rechterkant is de beeltenis van de overvloed van contigs binnen de bevolking van virus contigs gekoppeld aan de Caulimoviridae familie, Badnavirus geslacht en drie nauwverwante soorten grafiek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 . Karakterisering van CaYMAV-1 en CaYMV-Ap01 genomen. (A) schetsmatig vertegenwoordiging van Canna geel mottle virus 1 koppelen (CaYMAV) en Canna geel mottle virus soortgelijk aan het genoom van geïsoleerd Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nucleotide posities 1-10 is aangemerkt als het begin van het genoom en bevat een tRNAontmoette anticodon site typisch van de meeste badnavirus genomen. De stop- en start posities voor vertaling van open leesraam (ORF) 1 en 2 zijn naast. Deze proteïnen hebben onbekende functies. ORF3 is een polyprotein met zink vinger (ZnF), protease (Pro), reverse-transcriptase (RT) en RNAse H domeinen. Een 3′ poly(A) signaal reeks wordt bewaard voor beide genoom van het virus. (B) RT-PCR analyse werd uitgevoerd met behulp van RNA geïsoleerd van virus besmette bladeren en inleidingen die detecteren van CaYMAV en CaYMV-Ap01. In dezelfde populatie van 12 planten, werden drie besmet met CaYMV-Ap01, terwijl de resterende besmet waren met zowel CaYMAV als CaYMV-Ap01. (+) geeft aan positieve controle en (-) geeft aan negatieve controle. Dit cijfer is gereproduceerd/gewijzigd van Wijayasekara et al. 24 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In de afgelopen jaren te studeren plant virus biodiversiteit in natuurgebieden waaronder verrijken voor virusachtige deeltjes (VLP) of virus specifieke RNA of DNA2,3,44, een verscheidenheid van methoden zijn tewerkgesteld 45,46 . Deze methoden worden gevolgd door NGS en bioinformatic analyse. Het doel van deze studie was om te vinden van het causaal agens van een gemeenschappelijk ziekte in een gecultiveerde plant. De ziekte werd gemeld dat het resultaat van een onbekend virus dat niet-gehuld bacilliform deeltjes heeft, en waarvoor is slechts een 565 bp fragment gekloonde47. Deze informatie was voldoende voor voorafgaande onderzoekers hypothetisch toewijzen van het virus aan het geslacht Badnavirus binnen de familie Caulimoviridae. Terwijl voorafgaande verslagen veronderstelde dat canna mottle ziekte in canna lelies het resultaat van een enkel badnavirus was, met behulp van de metagenomics-aanpak in deze studie, vastbesloten wij dat de ziekte werd veroorzaakt door de twee voorlopige badnavirus soorten24. De kracht van het gebruik van een metagenome aanpak om te ontdekken het oorzakelijke agens van een ziekte is dus dat we nu van situaties identificeren kunnen waar er mogelijk meer dan één oorzaak.

Onze benadering combineren van DNA en RNA sequencing gegevens is grondig en toont ook aan dat de resultaten met behulp van twee benaderingen consistente resultaten opgeleverd en bevestigd van de aanwezigheid van twee verwante virussen. We een gewijzigde procedure voor isolatie van de caulimoviruses in dienst en een monster dat voor virus geassocieerde nucleïnezuren werd verrijkt en die werden beschermd binnen het virus Eiwitmantel geproduceerd. Een servicelaboratorium werd gecontracteerd voor het verrichten van DNA sequencing. Het essentieel concept voor DOVO sequencing is dat DNA-polymerase bevat de TL label nucleotiden in een sjabloon bundel van DNA tijdens opeenvolgende cycli van DNA-synthese. De contigs gemonteerd gevolgd door NGS werden ingediend in een bioinformatic workflow produceren een paar contigs die werden geïdentificeerd als virus contigs. Nog een bevestiging van twee virus genomen10,24,48,49,50 werd verkregen door middel van bioinformatic analyse van RNA-seq gegevens verkregen uit RNA-preparaten ribo-uitgeput. Een interessante uitkomst was om te leren dat de bevolking van sequenties teruggevorderd met DNA en RNA sequencing voorzien soortgelijke distributies van niet-virale en virale nucleïnezuren. Voor DNA en RNA sequencing, < 0,5% van sequenties werden van oorsprong van het virus. Binnen de bevolking van virus sequenties 78-82% tot de familie Caulimoviridae behoorde. Door het vergelijken van de geassembleerde virus contigs van DNA en RNA sequencing, bevestigd we hebben dat het twee geassembleerde genoom in beide datasets plaatsgevonden.

Een punt van zorg van het gebruik van enige DNA rangschikkend om te identificeren van het nieuwe virus genoom is het genoom van de badnavirus een open circulaire DNA. Wij vermoedde dat sequenties overlappende discontinuïteiten in het genoom obstakels voor genoom montage van contigs zou kunnen voorstellen. Eerste onderzoek van het DNA rangschikkend resultaten bleek twee soortgelijke genoom van het virus. We veronderstelde dat deze genomen hetzij vertegenwoordigd genetische diversiteit van een soort die niet is onderzocht of vertegenwoordigde twee soorten mede het infecteren van dezelfde plant24. De analyse van de collectieve bioinformatic van datasets verkregen door NGS DNA en RNA sequencing, ingeschakeld dus de bevestiging van de aanwezigheid van twee volle lengte genomen.

Er is een ander verslag dat een alternatieve methode voor de extractie van VLP en nucleïnezuren van plant homogenates voor metagenomic studies, gebaseerd op procedures om te herstellen van DNA van bloemkool mosaic virus (CaMV; een caulimovirus)3ontwikkeld. Deze aanpak geïdentificeerd roman RNA en DNA-virus sequenties in niet-gekweekte planten. De stappen die zijn afgeleid van de caulimovirus isolatie procedure in deze studie gebruikt om te ontdekken het oorzakelijke agens van een ziekte van geteelde planten zijn anders dan de stappen voor het extraheren van de VLP van natuurlijk geïnfecteerde planten24afgeleid. Het succes van beide gemodificeerde methoden suggereert dat de procedure voor de isolatie van de caulimovirus kan een waardevol uitgangspunt voor metagenomic studies van plantenvirussen in het algemeen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoek werd gefinancierd door Oklahoma Center voor de vooruitgang van wetenschap en technologie toegepast onderzoek programma fase II AR 132-053-2; en door het departement van de Oklahoma van landbouw Specialty gewassen onderzoek subsidie programma. Wij danken Dr. HongJin Hwang en de OSU Bioinformatics Core faciliteit die werd gesteund door subsidies van NSF (EOS-0132534) en NIH (2P20RR016478-04 en 1P20RR16478-02 5P20RR15564-03).

Materials

NaH2PO4 Sigma-Aldrich St. Louis MO S5976 Grinding buffer for virus purification
Na2HPO4 Sigma-Aldrich  S0751 Grinding buffer for virus purification
Na2SO3 Thermo-Fisher Waltham, MA 28790 Grinding buffer for virus purification
urea Thermo-Fisher PB169-212 Homogenate extraction 
Triton X-100 Sigma-Aldrich  X-100 Homogenate extraction 
Cheesecloth VWR Radnor, PA 21910-107 Filter homogenate 
Tris  Thermo-Fisher BP152-5 Pellet resuspension& DNA resuspension buffers 
MgCl2 Spectrum, Gardena, CA M1035 Pellet resuspension buffer
EDTA Spectrum E1045 Stops enzyme reactions
Proteinase K Thermo-Fisher 25530 DNA resuspension buffer
phenol:chloroform:isoamylalcohol  Sigma-Aldrich P2069 Dissolve virion proteins
DNAse I Promega M6101 Degrade cellular DNA from extracts
95% ethanol Sigma-Aldrich 6B-100 Virus DNA precipitation
Laboratory blender VWR 58984-030 Grind leaf samples
Floor model ultracentrifuge  &Ti70 rotor Beckman Coulter, Irving TX  A94471 Separation of cellular extracts
Floor model centrifuge and JA-14 rotor Beckman Coulter  369001 Separation of cellular extracts
Magnetic stir plate VWR 75876-022 Mixing urea into samples overnight
Rubber policeman VWR 470104-462 Dissolve virus pellet
 2100 bioanalyzer Instrument Agilent Genomics, Santa Clare, CA G2939BA Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip 5067-1513 Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip 5067-4626 Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer
Nanodrop spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Plant total RNA isolation kit Sigma-Aldrich STRN50-1KT Isolate RNA for RNA-seq
RNase-free water  VWR 10128-514 Resuspension of DNA and RNA for NGS
RNA concentrator spin column Zymo Research, Irvine, CA R1013 Prepare RNA for RNA-seq
rRNA removal kit Illumina, San Diego, CA MRZPL116 Prepare RNA for RNA-seq
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Prepare RNA for RNA-seq
 RNA  enrichment system Roche 7277300001 Prepare RNA for RNA-seq
Agarose  Thermo-Fisher 16500100 Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Ethidium bromide Thermo-Fisher 15585011 Agarose gel staining
pGEM-T +JM109 competent cells Promega, Madison, WI A3610 Clone genome fragments
pFU Taq polymerase Promega M7741 PCR amplify virus genome
dNTPs Promega U1511 PCR amplify virus genome
PCR oligonucleotides IDT, Coralvill, IA Custom order PCR amplify virus genome
Miniprep DNA purification kit Promega A1330 Plasmid DNA purification prior to sequencing
PCR clean-up kit Promega A9281 Prepare PCR products for cloning
pDRAW32 software ACAClone Computer analysis of circular DNA and motifs
MEGA6.0 software MEGA Molecular evolutionary genetics analysis
Primer 3.0 Simgene.com
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit Thermo-Fisher R11490 Fluorometric determination of RNA quantity
GS Junior™ pyrosequencing System Roche 5526337001 Sequencing platform
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) Roche 5996520001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents Roche 5996490001 Reagents for emulsion PCR
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) Roche 5996538001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit Roche 5996511001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr Titanium Sequenicing kit* Roche 5996554001 Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit Roche 5996619001 Sequencing plate with associated reagents and gaskets
IKA Turrax mixer 3646000 Special mixer used with Turrax Tubes
IKA Turrax Tube (specialized mixer) 20003213 Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions
GS Nebulizers Kit Roche 5160570001 Nucleic acid size fractionator for use during library preparations
GS Junior emPCR Bead Counter Roche 05 996 635 001 Library bead counter
GS Junior Bead Deposition Device Roche 05 996 473 001 Holder for Picotiter plate during centrifugation
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices Roche 05 889 103 001 Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation
GS Junior Software Roche 05 996 643 001 Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Run Processor v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS De Novo Assembler v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Reference Mapper v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dijkstra, J., Jager, C. P. . Practical Plant Virology : Protocols and Exercises. , (1998).
  2. Roossinck, M. J. Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology. Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).
  3. Melcher, U., et al. Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya. J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).
  4. Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay. Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).
  5. Borah, B. K., et al. Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group. Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).
  6. Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences. Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).
  7. Geering, A. D., et al. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. J Gen Virol. 86, 511-520 (2005).
  8. Kunii, M., et al. Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution. BMC Genomics. 5, 80 (2004).
  9. Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm. Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).
  10. Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species. Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).
  11. Gayral, P., et al. A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus. J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).
  12. Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora. AoB Plants. 2011, 008 (2011).
  13. Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).
  14. Singh, K., Talla, A., Qiu, W. Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs. Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).
  15. Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run. J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).
  16. Kreuze, J. F., et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388 (1), 1-7 (2009).
  17. Zheng, Y., et al. VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs. Virology. 500, 130-138 (2017).
  18. James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).
  19. Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India. Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).
  20. Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2. Virus Res. 238, 29-34 (2017).
  21. BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses. Viruses. 8 (7), (2016).
  22. Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida. Plant Health Progress. , 2-4 (2004).
  23. Zhang, J., et al. Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii. Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).
  24. Wijayasekara, D., et al. Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease. Virus Res. 243, 19-24 (2018).
  25. Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. Caulimovirus isolation and DNA extraction. Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn. , (1989).
  27. Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J Gen Virol. 93, 1853-1868 (2012).
  28. Kanagal-Shamanna, R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).
  29. Getts, D. R., et al. Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages. J Neuroinflammation. 9, 246 (2012).
  30. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  31. . Gel filtration principles and methods. GE Healthcare. , (2010).
  32. Goff, S., et al. The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology. Frontiers in Plant Science. 2, (2011).
  33. Lin, Z., et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets. J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).
  34. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, 597-603 (2012).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5, 113 (2004).
  36. Hung, J. H., Weng, Z. Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).
  37. Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review. Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).
  38. Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
  39. Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191 (2013).
  40. Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
  41. Moeller, J. R., et al. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
  42. Grooms, K. . Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa. , (2015).
  43. Nishimori, A., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. PLoS One. 12 (4), 0174916 (2017).
  44. Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Roossinck, M. J. . Plant Virus Evolution. 1, 27-51 (2008).
  45. Roossinck, M. J. The big unknown: plant virus biodiversity. Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).
  46. Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).
  47. Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. . Plant Health Progress. , (2004).
  48. Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.). Archives of Virology. 153 (12), 2263-2272 (2008).
  49. Harper, G., et al. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).
  50. Muller, E., Sackey, S. Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences. Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).

Tags

DNA AnalysisCrude Virion ExtractionRNA AnalysisInfected LeavesNew Virus GenomesEnvironmental VirologyBadnavirusesHomogenizationDifferential CentrifugationBio-analyzerLaboratory ProtocolLeaf GrindingUreaDetergentCentrifugationPellet SeparationVirus PurificationDNA Sequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Verchot, J., Thapa, A., Wijayasekara, D., Hoyt, P. R. Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes. J. Vis. Exp. (137), e57855, doi:10.3791/57855 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image