Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

1. genel virüs arıtma fark Santrifüjü Covey vd tarafından standart yöntemi kullanarak tarafından 25 İlk olarak, 80-100 g hastalıklı bitki yapraklarından, kesmek ve eziyet 200 mL arabellek zımpara kullanarak 4 ° C’de WARING bir karıştırıcıda (0,5 M NaH2PO4, 0, 5 M Na2HPO4 (pH 7.2). ve %0,5 (w/v) Na2SO3). Bir laboratuvar kat ve bu yordamın tüm adımları için eldiven giymek. Ardından homogenate (300 mL) 1.0 L kabı aktarın. 18 g üre ve 25 mL % 10 Noniyonik deterjan (t-Ekim-C6H4-(OCH2CH2)9OH) homogenate içinde kimyasal bir başlık ekleyin.Not: Bu adım için koruyucu gözlük ve kişisel koruma için basit nefes maske giymek en iyisidir. Kısaca mahalledeki bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın ve kabı folyo ile kaplayın. Sonra folyo kaplı kabı soğuk bir odaya transfer ve gecede 4 ° C’de bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın Rotor şişe (250 mL konteynerler) ve 4 ° C’de 10 dakika için 4.000 x g de sabit açılı rotor santrifüje santrifüj kapasitesi homogenate aktarma Bir kimyasal duman başlık, süpernatant ve tülbent 4 kat filtreden kurtarmak. Homogenate 38,5 mL polipropilen santrifüj tüpleri ve santrifüj 40.000 x g 4 ° C’de de 2,5 h arasında bölmek Genellikle, bir yeşil Pelet tüpün dibinde ve tüp uzunluğu boyunca beyaz bir Pelet varlığı için kontrol edin. Her iki Pelet korumak ve süpernatant dökün; örnekleri buza koyun.Not: Yeşil Pelet kloroplast, nişasta ve diğer organelleri içerir. Kimyasal bir mahallede çalışma, bir lastik polis granül ayırmak için kullanın. GKD2O her rotor şişe 1 ml beyaz Pelet süspansiyonlar 4 ° C’de malzemeleri tam çözümde dağıtmak izin vermek için bir gecede korunarak 1-2 saat boyunca resuspend. Süspansiyon 6.000 g x ve 4 ° C için kalan enkaz kaldırmak 10 dk santrifüj kapasitesi. 136,000 x g 4 ° C’de virions cips için 2 h için de konsantre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Granül 1 mL arabellek (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2) resuspend.Not: İsteğe bağlı bir adım virions DNaz ile tedavi etmektir ben (10 µg/mL) 37 ° C’de encapsidated DNA, kloroplast ve mitokondri DNA kirletici Yani, kaldırmak için 10 dakika. O zaman, DNaz devre dışı bırakın ben 1 mM EDTA ekleyerek. Virions ile 2 µg/µL İndinavir K 15 dakika 37 ° C’de 40 µL bozabilir. Virion DNA tarafından organik ayıklama kurtarmak için kimyasal bir başlık içinde çalışmak. Potansiyel Akut sağlık etkileri karşı koruma için ayıklama sırasında yüz kalkan, eldiven ve bir laboratuvar ceket giymek. Fenol kloroform izoamil alkol (49:50:1) 1 birim için örnek eklemek ve 16.000 x g., 5 min kaldırmak için üst sulu faz ve yeni bir tüp aktarmak için oda sıcaklığında 20 s. santrifüj el ile çalkalanır. Bu ayıklama iki kez tekrarlayın. Organik aşaması için uygun kurumsal kimyasal atık26cam atık şişe koyarak atın. Etanol yağış kullanarak DNA konsantre. Sodyum asetat (pH 5.2) 0,3 M son konsantrasyonu kullanın ve %2.5 95 etanol hacimleri. Örnekleri-20 ° C-30-60 dk ve santrifüj 13.000 x g 10-20 dk DNA26cips de yerleştirin. Bir laboratuvar tezgah çalışma, DNA pelet 1 mL 0.1 mM TE arabellek (pH 8.0) resuspend. Filler üzerinden (normalde polimeraz zincir tepkimesi (PCR) temizlemek kullanılır) ticari jel filtrasyon sütun süspansiyon tuzları ve NGS engel düşük moleküler ağırlıklı malzeme ortadan kaldırmak için. Örnekleri arasında etidyum bromür hazırlıkları kalitesini görüntülemek için boyama kullanarak % 1’özel jel elektroforez tarafından analiz. DNA nanodrop spektrofotometre kullanarak kalitesini değerlendirmek.Not: 260 λ ve 280 λ 1.85 ve 2.0 arasında örnek absorbans oranı genellikle hazırlık “temiz” kirleri ve istenen kaliteye sahip gösterir. DNA kalitesini analiz (5 10 sayfaya kullanın ng) kapiler Elektroforez araç tabanlı bir çip kullanılarak.Not: Temiz tepeler, DNA parçalarının boyutu bir x ekseni boyunca dağıtım şirketi temsil eden kaliteli çıkışı gösterir. En yüksek yükseklik bereket parça gösterir. Sivri tepeler kısmen bozulmuş parçaları veya kimyasal kirleticiler gösteriyor. Bir smear kalitesiz gösteren DNA’ın yuvarlak eğrileri temsil 2. Kütüphane hazırlık kullanma DNA ve klonal amplifikasyon (emPCR amplifikasyon) emülsiyon esaslı Not: Kütüphane genellikle müşteri odaklı çalışma taşıyan bir NGS tesis tarafından hazırlanmıştır. DNA parçaları dönüştürür bir Nebulizatör kullanarak bir çözüm DNA (> 200 ng) kesme. Kitabın yönergeleri27göre ticari bağdaştırıcıları ligate. DNA örneği üreticinin yönergeleri28,29,30göre amplifikasyon emPCR yerine getirir. Üç kez yıkama adımı yineleyin ve her yıkama sonra bir minicentrifuge boncuk için 10 s. atma süpernatant her yıkama sonra cips.Not: Yordamı çamaşır kit ile sağlanan ticari yıkama arabellek tarafından yakalama boncuk hazırlanması ile başlar. emPCR için şablon amplifikasyon NGS için yaygın olarak kullanılır. Isı denatüre DNA veya RNA 95 ° C’de 2 min ve o zaman 4 ° C kadar kullanıma hazır. Kullanım 200 – milyon moleküllerinin DNA/RNA son hacmi 30 µL. 5 milyon yakalama boncuklar DNA/RNA örnek ve nükleik asit örnek hem de sahte örnek aşağıdaki adımları gerçekleştirmek yanında sahte bir örnek hazırlamak. Emulsiyon vortexing emülsiyon petrol 10 için tüp yerine getirilir s maksimum hızda sonra bir platform homogenizer ile uyumlu olan tüp karıştırarak bir plastik içine tüm içeriği (4 mL) dökün. Karıştırma tüp 5 min için 2.000 devirde emülsiyon karıştırmak için bir platform üzerine yerleştirin. Emülsiyon 100 µL aliquots 8-şerit kap tüpler veya bir 96-şey plaka dağıtmak. Tüpler kap veya plaka mühür ve üreticinin önerilen program28kullanarak emPCR taşımak.Not: PCR tamamlandığında, emülsiyon sağlam olup olmadığını ve sonra devam etmek için kuyu olup olmadığını denetleyin. Emülsiyon çalışmıyorsa tüm şey atmak. Önlük giymek ve güçlendirilmiş DNA boncuk (ADB) toplamak için kimyasal bir mahallede çalışma. Vakum kuyulardan emülsiyon Aspire edin ve bir 50 mL tüp boncuk toplamak. İsopropanol 100 µL iki kez Wells’le durulama ve aynı 50 mL tüp için durulama Aspire edin. Girdap toplanan emülsiyonlar ve ADB son hacmi 35 mL için isopropanol ile resuspend. ADB vasıl 930 x g 5 dk. Kaldır süpernatant cips ve arabellek geliştirme 10 mL ekleyin. Girdap ADB ve her yıkama ve iki kez yıkama adımı yineleyin sonra 40 mL son hacim santrifüj isopropanol ve atma süpernatant ekleme tarafından o zaman yıkama. Etanol isopropanol yerine kullanarak son yıkama yerine getirir. Eklemek 35 mL son hacim, girdap ve Pelet arabelleğe artırılması vasıl 930 x g 5 dakika süreyle boncuk süpernatant kaldırmayı ancak arabellek geliştirme 2 mL bırakmak. Süspansiyon microcentrifuge tüp aktarmak ve kısaca ADB cips santrifüj kapasitesi. Süpernatant discarding sonra ADB Pelet iki kez artırılması arabelleği 1 mL ile yıkayın. Santrifüj kapasitesi ve süpernatant her yıkama sonra atın. DNA Kütüphane boncuk zenginleştirme için hazırlamak için boncuk 1 mL 1 N NaOH ekleyin. Girdap ADB ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Bir kez bu yıkama tekrarlayın. Tavlama arabellek, sonra girdap ADB 1 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Kısaca santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Tekrar 100 µL tavlama arabelleği kullanarak bu adımı yineleyin. DNA için sıralama astar tavlama Seq astar a 15 µL ve Seq astar kit ile sağlanan b 15 µL ekleyin. Kısaca vortexing tarafından mix ve 5 dk. 2 min için buz Transfer 65 ° C ısı bloğunda microcentrifuge tüpü yerleştirin. Üç kez 1.0 arabellek tavlama mL ile yıkayın. 5 s ve atma süpernatant her zaman için girdap. Sıralama daha önce bir ticari boncuk sayaç boncuk sayısını ölçmek. En az 500.000 zenginleştirilmiş boncuk olmalıdır.Not: Boncuk sayaç bir sağlanan microcentrifuge tüp boncuk ölçer özel bir aygıttır. 3. genel mRNA yalıtım ve dsDNA sentez başlangıç ile enfekte Canna test yaprakları tarafından RT-PCR CaYMV kullanarak bildirilen tanılama astarlar için Bir laboratuvar kat ve lateks eldiven kişisel koruma için tüm sonraki adımlar giymek. Bir laboratuvar tezgah çalışma, yapraklarından 12 örnekler toplamak ve örnekleri sıvı azot Dalma. Bir boncuk değirmen homojenizasyon için kullanın. Toplam bitki RNA izolasyon için standart bir sütun tabanlı yöntem sağlar bir ticari seti kullanın. 20 için belgili tanımlık teçhizat zemin örnek ve sallamak için sağladığı guanidin-isothiocyanate lizis arabellek eklemek s. Etanol ve kit yönergelerine göre iyice karıştırın. Her homogenate RNA membran için bağlar bir spin sütun ekleyin. Üç kez yıkama ve RNA kurtarma tüp24elute. 260 λ ve % 1’özel jel elektroforez etidyum bromür ile lekeli kullanarak 280 λ. bütünlük doğrulama RNA absorbans oranı ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak RNA ölçmek.Not: 1.85 bir absorbans oranı 2.0 hazırlık istenen kalite olduğunu gösterir. RNA DNaz ile tedavi 37 ° C’de 10 dakika ben (10 µg/mL) Bir ticari spin sütun RNA RNase free su31′ de konsantre için kullanın. Devam etmeden önce havuzu RNA örnekleri. Bir rRNA kaldırma kiti bitki ribozomal RNA kaldırmak için kullanın. Microcentrifuge tüp ve iki kez yıkama aliquot manyetik boncuklar RNase free ile su. Girdap resuspend için aliquot tüp tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve sıvı temizlemek bekleyin. Süpernatant atın ve yerine koymak ile manyetik boncuk resuspension eriyik. Girdap resuspend ve RNase inhibitörü 1 µL eklemek için.Not: Bu tür kitleri oligo-dT için mRNA melezlemek manyetik boncuklar bağlı kullanın. Transkript24kurtarmak için standart mıknatıs boncuk ayırma teknoloji yöntemini kullanır. RNA, 1,25 µg birleştirmek 500 ng RNase free su ve reaksiyon arabellekleri kit tarafından sağlanan. Yer 50 ° C’de 10 dakika karışımı Kaldır ısı ve yıkanmış manyetik boncuklar RNAse free suya ekleyin. Kısaca girdap ve oda sıcaklığında 5 min için kullanýlýr. Manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve sıvı temizlemek bekleyin. Süpernatant temiz microcentrifuge tüp aktarın. Buz üzerinde ayarlayın. Exosomes ve 200 zenginlik için bir çözüm tabanlı yakalama yöntemi kullanın ng cDNA Kütüphanesi hazırlamak için RNA’ın.Not: Çift Kişilik strand cDNA Kütüphanesi genellikle müşteri odaklı çalışma taşıyan bir NGS tesis tarafından hazırlanmıştır. Piyasada satılan bir RNA parçalanma solüsyonu (0.136 g ZnCl2 ve 100 mM Tris-HCl pH 7,0) kullanarak RNA parçası. Çözüm 2 µL RNA’ın 18 µL ekleyin (200 ng toplam). Microcentrifuge kısaca tüplerde spin, 70 ° C 30 s ve buz için transfer için örnekleri yerleştirin. 0, 5 M EDTA pH 8.0 ve 28 µL 10 mM Tris-HCl pH 7.5 2 µL kullanarak tepki bırak. Bağlama RNA, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle karıştırma tarafından manyetik boncuklar için boncuk toplamak ve süpernatant atmak için manyetik yoğunlaştırıcı kullanın. Boncuk üç kez 200 µL % 70 etanol ile yıkayın. Her yıkama ve kuru hava atma pelleted boncuk 3 dakika süreyle oda sıcaklığında 10 mM Tris-HCl pH 7.5 19 µL içinde Resuspend. 70 ° c 10 dk Isıtma tarafından parçalanmış RNA rasgele astar tavlama ve tüp buz 2 dk. hazırla ilk strand ve bir standart ticari cDNA sentez kit kullanarak ikinci strand cDNA yerleştirin. Manyetik boncuk yoğunlaştırıcı kullanarak iki iplikçikli cDNA arındırmak. % 70 etanol 800 µL ile üç kez yıkayın. Her yıkama ve kuru hava atma granül 3 dakika süreyle oda sıcaklığında 10 mM Tris-HCl pH 7.5 16 µL içinde Resuspend. Manyetik boncuk yoğunlaştırıcı boncuk şimdi çözümdür çift iplikçikli cDNA ayırmak için kullanın. CDNA yeni 200 µL PCR tüp içine pipetting tarafından kaldırın. Taq polimeraz ve ticari Kütüphane hazırlık seti tarafından sağlanan deoxyribonucleotides karışımı kullanarak parça son onarım gerçekleştirmek. Ticari seti her iki ucuna ticari ligaz 25 ° C’de 10 dakikadır kullanarak iki iplikçikli cDNA eklemek için önceden seyreltilmiş bağdaştırıcılar sağlar. 4. NGS DNA kitaplığı hazırlanmış ham virüs hazırlık ve dsDNA mRNA kitaplığı hazırlanmış DNA dizilerinin doğrudan sonuçlar üretmek için tüm önerilen üreticileri protokolleri takip ve bir standart yüksek işlem hacmi pyrosequencing aleti kullanın. Ticari sıralama reaktifler, Fluorescently etiketli nükleotit dahil olmak üzere kullanın.Not: için Ayrıntılar araç ile sağlanan üretici yönergelerine bakın. Sonrası sıralama analiz otomatik olarak contigs ilk dizi < 700 bp. ortalama uzunluğu ile üretmek için okuma çeviren genom derleme yazılım kullanarak yürütmek kalite kontrol gerçekleştirir iPlant/CyVerse Web sitesinde FastQC yazılımlar ham sıralı veri32üzerinde denetimler. Serileri ile Phred puanları ≥ 30 haritalama ve amplicon yazılım kullanarak daha küçük sıra Okunma24 uzun serileri birleştirmeye devam etmek için seçin.Not: için üreticinin yönerge ayrıntıları bakın. MEGABLAST varsayılan modül hem de Viridplantae NCBI-BLASTn analiz için monte bu contigs gönderin (TaxID: 33090) ve virüsler (TaxID: 10239) organizmalar sınırlama33isimleri gibi. Toplamak için yüksek benzerliği göstermek contigs subpopulation Badnavirus genleri bir raporda bildirdi. Aday tam uzunlukta virüs genleri, bir veya daha fazla temsil birleştirilen iskele düzgün standart badnavirus genom olarak aynı örgüt-si olmak çerçeve diziler üretmek doğrulayın. Bunu yapmak için aday tam uzunlukta virüs genomu yazılım çizim bir plazmid girdi. Sonra ilk 15 nükleotit oluşur hangi badnaviruses arasında son derece korunmuş bir tRNAbir araya geldi (TGGTATCAGAGCGAG) onaylayın. Potansiyel Poliadenilasyon sinyal sonuna 3′ genom bulun. İki küçük ORFs ve bir polyprotein kodlama bir büyük ORF varlığı tanımlamak için komple genom açıklama ekleyin. Sonra kullanım ExPASy portalı çevirme aracı ORF1, ORF2 ve ORF3 çeviri ürünler34badnavirus tespit etmek.Not: Bu bilimsel yazılım ücretsiz ve dairesel DNA oluşturmak, tüm açık okuma tespit çerçeveler ve sıra tam uzunlukta dairesel DNA genom temsil ettiğini doğrulamak için bir acil çıkış sağlar. Açık kaynak birden çok sıra karşılaştırma araçları, kas ve İLOGENETİK, DNA ve RNA analizleri35,36elde virüs genleri karşılaştırmak için kullanın. 30 badnavirus türlerin tam genom dizileri elde edilir ve .fasta biçiminde bir belge olarak dışa aktarın NCBI nükleotit veritabanında arama yapın. Diziler dizileri NGS tarafından elde edilen virüsü genom dizileri birlikte evrimsel Genetik Analizi yürütmektedir bir yazılım yükleyin. Birden fazla sıra hizalamaları ve maksimum olabilirlik ağaçlar kas37kullanarak oluşturun. 5. kalite De Novo sıralama PCR güçlendirme virüs genleri enfekte bitkiler tarafından değerlendirilmesi PCR astar38türetmek için ücretsiz çevrimiçi Primer3 araç içine yeni tanımlanan tam uzunlukta badnavirus genom dizileri (.fasta formatında) girdi. 1.000-1.500 BP virüs genome(s) tüm uzunluğu boyunca sendeleyerek ürünleri üretecek astar kümeleri tanımlar. Dizileri sentez ve PCR astar sağlayan bir servise göndermek.Not: Çıkış yaygın ve kabul edilebilir erime sıcaklıkları ve hassas astar konumları tanıtılan sıraları boyunca kabul edilebilir astar çiftleri tanımlar. Bir laboratuvar tezgah çalışma ve önlük ve eldiven giyiyor, DNA 5 µg bitki malzeme39 DNA izole etmek için standart paramagnetic selüloz parçacıklar içerir otomatik bir yöntem kullanarak virüs bulaşmış ve sağlıklı kontrol yapraklarından izole etmek. Bir microcentrifuge tüp sıvı azot yaprak malzeme (20-40 mg) donma ve Boncuk Değirmen kullanarak eziyet. Örnek bir microcentrifuge tüp lizis arabelleği ile birleştirmek ve her örnek için RNase A ekleyin. Girdap örnek 10-20 s ve kısa bir süre spin katı parçacıkları kaldırmak için örnek.Not: Paramagnetic selüloz parçacıklar yüksek DNA’ya bağlanıcı kapasitesine sahip ve yüksek verim saf DNA’ın izole. Standart ticari silis sütun yöntemleri DNA izolasyonu için etkili bir şekilde DNA çeşitli bitki türleri arasında ayıklamak değil. Sonuç olarak, onlarca Yöntem değişiklikleri tek tek bitki türleri verimliliği artırmak için bu yordamlardan birini olan mevcut. 25’ten fazla otsu Gadidae türler40daha fazla ve daha yüksek kalitede DNA verimleri çünkü otomatik paramagnetic selüloz parçacık yöntemi seçilmiştir. Ticari reaktif kartuşlarını otomatik paramagnetic DNA izolasyon için kullanın. Her ticari reaktif Kartuşu ve transfer bitki aynı kartuş ile lysate 300 µL nükleaz boş su ekleyin. Kartuş kartuş rafa yerleştirin, elüsyon Tube En yakın iyi bir dalgıç yerleştirin ve elüsyon arabellek elüsyon tüp içine yerleştirin. Kartuşları otomatik nükleik asit yalıtım makineye yükleyin ve bitki DNA izolasyon protokol41,42çalıştırın. Üst üste gelen PCR ürünleri bir dizi türetmek için PCR taşımak. Her ileriye ve geriye doğru astar 5 mikron PCR güçlendirme 35 döngüleri ile kullanın. Aşağıdaki Bisiklet koşullarını kullanın: denatürasyon 95 ° c 60 s, 7-10 dakika ortadan kaldırmak için bir hazır ambalajlı jel filtrasyon sütun kullanım tuzlar için 45 s ve uzantısına sahip bir son 72 ° c için 1-2 dk 72 ° C’de uzantısı için 50 ° C’de tavlama ve düşük moleküler ağırlıklı malzemesi olarak Adım 1.231′ de. 50’ye ligate için PCR ürünü miktarını belirlemek için vektör için PCR ürünü 3:1 molar oranını hesaplamak ng Doğrusallaştırılmış pGEM plazmid43. Bir denetim ekleyin DNA d verimli bir biçimde çalışması olup olmadığını belirlemek için kullanın. Gecede 4 ° C’de T4 DNA ligaz (3 U/µL) kullanarak birleştirmesini gerçekleştirmek Sonra dönüşüm ticari olarak hazırlanan JM109 yetkili Escherichia coli hücreleri. Kullanımı verimli dönüştürme için pozitif kontrol olarak kesilmemiş plazmid DNA 100 pg kontrol. 100 µL üzerine LB-ağar kaplamalar dönüştürülmüş hücrelerin ve birleştirilmiş plazmid26kurtarmak için antibiyotik ve mavi/beyaz seçimle plaka. Kaplamalar, 16-24 h 37 ° C’de için kuluçkayaNot: PGEM vektör β-galaktozidaz kodlar bir lacZ gen vardır. Bir plaka üzerinde yetiştirilen dönüştürülmüş bakteri içeren 100 µg/mL ampisilin, 0,5 mM IPTG, 80 µg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) β-galaktozidaz etkinliği nedeniyle mavi dönecek. PGEM plazmid lacZ gen bozan bir şekilde Doğrusallaştırılmış. PCR ürünü ekler içeren koloniler lacZ gen bozabilir ve X-gal metabolize değil. Bu koloniler beyazdır. Böylece kolonileri bir ekleme ile o olmadan bir ekleme kolonisi (mavi beyaz)26renk tarafından ayrıştırılan. Standart sütun tabanlı plasmid izolasyon kit39kullanarak üç kolonilerden DNA izole et. Dönüştürme ürünün üç plazmid sıra. Her DNA dizisi NGS tarafından üretilen monte de novo virüs genleri ile karşılaştırın. İLOGENETİK dizileri hizalamak için ve uygun bir şekilde sıralanır emin olmak için kullanın.