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Immunology and Infection

Combinant l’analyse de l’ADN dans une Extraction de Virion brut avec l’analyse de l’ARN des feuilles infectées pour découvrir de nouveaux génomes de Virus

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57855
, , ,
1Texas A&M Agrilife Center at Dallas, 2Noble Research Center,Oklahoma State University, 3Department of Biology, College of Engineering and Natural Sciences,The University of Tulsa, 4Bioinformatics and Genomics Core Facility, Department of Biochemistry and Molecular Biology,Oklahoma State University

Summary

Nous présentons ici une nouvelle approche pour identifier les virus végétaux avec les génomes d’ADN double brin. Nous utilisons des méthodes standard pour extraire l’ADN et l’ARN de feuilles infectées et de réaliser le séquençage de prochaine génération. Outils bioinformatiques assemblent des séquences en contigs, identifient des contigs représentant les génomes de virus et affecter des génomes aux groupes taxonomiques.

Abstract

Cette approche de métagénome sert à identifier les virus de plantes avec les génomes d’ADN circulaires et leurs transcriptions. Souvent les virus de l’ADN de plantes qui se produisent dans des titres faibles dans leur hôte ou ne peut pas être inoculés mécaniquement à un autre hôte sont difficiles à propager pour atteindre un plus grand titre de matières infectieuses. Les feuilles infectées sont broyés dans un tampon doux pH optimal et de composition ionique recommandé pour purifier les rétrovirus Para bacilliformes la plupart. L’urée est utilisée de casser vers le haut de corps d’inclusion des virions d’intercepter et de dissoudre les composants cellulaires. Centrifugation différentielle fournit plus de séparation des virions de contaminants de la plante. Puis le traitement de la protéinase K supprime les capsides. Puis l’ADN viral est concentrée et utilisé pour l’ordonnancement de prochaine génération (NGS). Les données des end sont utilisées pour assembler des contigs qui sont soumis à NCBI-BLASTn pour identifier un sous-ensemble des séquences du virus dans le dataset généré. Dans un pipeline parallèle, l’ARN est isolé dans les feuilles infectées à l’aide d’une méthode d’extraction RNA standard basée sur les colonnes. Puis épuisement ribosome est effectué pour enrichir pour un sous-ensemble de transcriptions de virus et de l’ARNm. Assemblé séquences dérivées de l’ARN (RNA-seq) le séquençage ont été soumis au NCBI-BLASTn pour identifier un sous-ensemble des séquences du virus dans ce dataset. Dans notre étude, nous avons identifié deux génomes différents longs liés à deux séries de données. Cette méthode est préférable à une autre approche commune qui extrait la population globale de petites séquences d’ARN pour reconstituer des séquences génomiques de virus de plante. Ce dernier métagénomique pipeline récupère virus associés des séquences qui sont rétro-transcription des éléments insérés dans le génome de la plante. Ceci est couplé à des épreuves biochimiques ou moléculaires pour discerner davantage les agents infectieux activement. L’approche documentée dans cette étude, récupère les séquences représentant de réplication des virus qui probablement signe d’infection de virus actif.

Introduction

Maladies des plantes émergentes conduire les chercheurs à développer de nouveaux outils afin d’identifier les agents causals corrects. Rapports initiaux de maladies à virus nouveaux ou récurrents sont basés sur des symptômes fréquents tels que la mosaïque et des malformations des feuilles, nervures, nanisme, flétrissement, lésions, nécrose, ou d’autres symptômes. La norme pour la notification d’un nouveau virus étant l’agent causal d’une maladie pour le séparer des autres pathogènes contaminants, propager dans hôte convenable et reproduire la maladie en inoculant dans des plants sains de l’espèce hôte original. La limitation de cette approche est que beaucoup de genres de virus végétaux dépendent un insecte ou d’autres vecteurs de transmission d’un hôte convenable, ou retour à l’espèce hôte original. Dans ce cas, la recherche pour le vecteur approprié peut être prolongée, il peut y avoir des difficultés à établir des colonies de laboratoire du vecteur, et des efforts supplémentaires sont nécessaires pour élaborer un protocole de transmission expérimentale. Si les conditions d’études en transmission réussie de laboratoire ne peuvent être atteints, alors le travail en deçà la norme pour avoir signalé une nouvelle maladie virale. Pour les virus qui se produisent chez leurs hôtes naturels aux très faibles concentrations, chercheurs doivent identifier des hôtes alternes de multiplication afin de maintenir des stocks infectieuses suffisants pour mener à bien la recherche. Pour les espèces de virus qui infectent uniquement quelques plantes, cela peut aussi être un obstacle pour la croissance de cultures mères1.

Ces dernières années, les scientifiques emploient plus souvent haut débit NGS et métagénomique approches pour découvrir des séquences du virus présents dans l’environnement, ce qui peut exister sans rapport avec une maladie connue, mais peut être assigné aux genres et espèces taxonomiques 2 , 3 , 4. ces approches à la découverte et la catégorisation du matériel génétique dans un environnement distinct permettent de décrire la diversité des virus dans la nature ou leur présence dans un écosystème de certain mais ne confirme pas nécessairement à un cadre pour la définition agents causals de maladie apparente.

Le genre de virus appartient à la famille Caulimoviridae de pararetroviruses. Ces virus sont bacilliformes en forme avec le génome d’ADN circulaire double brin d’environ 7 à 9 kb. Tous les pararetroviruses se répliquer via un intermédiaire de RNA. Pararetroviruses existent extrachromosomale et répliquer indépendants de l’usine chromosomique ADN5,6. Études sur le terrain des populations de virus indiquent que les populations de ces virus sont génétiquement complexes. En outre, les informations obtenues dans un éventail de génomes de plantes par séquençage à haut débit ont découvert de nombreux exemples de différents fragments de génome insérés par les événements d’intégration illégitime dans les génomes végétaux. Ces séquences de virus endogènes ne sont pas nécessairement associés à infection7,8,9,10,11. Par la suite, l’utilisation de NGS pour identifier les nouveaux badnaviruses comme l’agent causal de la maladie est compliquée par la diversité de la sous-population des génomes épisomiques ainsi que la présence de séquences endogène12,13.

Bien qu’il n’y a pas un seul pipeline optimal pour la découverte des génomes pararétrovirus roman, il y a deux approches communes pour identifier ces virus comme agents responsables de maladies. Une méthode consiste à enrichir de petites séquences d’ARN de feuilles infectées et ensuite assembler ces séquences afin de reconstituer les virus analyses14,15,16,17. Une autre approche est l’amplification de cercle roulant (RCA) pour amplifier les génomes de virus à ADN circulaire18. Le succès de RCA dépend de l’âge de la feuille et le titre de virus dans les tissus choisis. Les produits RCA sont soumis à la digestion de restriction et clonés dans des plasmides direct sequencing19,20,21.

Virus de la panachure jaune de Canna (CaYMV) est un virus et est décrite comme étant la cause étiologique de la maladie de la panachure jaune chez canna, bien que seul un fragment de bp 565 du génome a été précédemment isolée de cannas infecté22. Une étude contemporaine a CaYMV en Alpinia purpurata (floraison gingembre ; CaYMV-Ap)23. L’objectif de cette étude était de récupérer les séquences du génome complet connu de lis canna infectés. Nous décrivons un protocole pour la purification des virus des contaminants de l’usine et ensuite isoler l’ADN viral de cette préparation et préparer une bibliothèque d’ADN à utiliser dans la NGS. Cette approche élimine le besoin d’étapes intermédiaires amplification moléculaire. Nous isolons également ARNm de plantes infectées pour NGS RNA-Seq., qui comprend la RNA-seq a été réalisée à l’aide de chaque préparation d’acide nucléique. Contigs assemblés trouvées se rapportant au taxon connu dans les deux ensembles de données à l’aide du Centre National de biotechnologie et l’Information (NCBI) outil de recherche de base alignement local pour les acides nucléiques (BLASTn). Nous avons identifié les génomes de deux différents espèces24.

Protocol

1. Généralités Virus Purification par Centrifugation différentielle en utilisant la méthode Standard de Covey et al. 25 Tout d’abord, couper 80-100 g de feuilles de plantes malades et broyer dans un mixeur waring à 4 ° C à l’aide de 200 mL de tampon de meulage (0,5 M NaH2PO4, 0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2). et 0,5 % (p/v) Na2SO3). Porter un manteau de laboratoire et des gants pour toutes les étapes de cette procédure. Ensuite, transférer l’homogénat (300 mL) dans un bécher de 1,0 L. Ajouter 25 mL de détergent non-ionique 10 % (t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)9OH) et de 18 g d’urée à l’homogénat à l’intérieur d’une hotte chimique.NOTE : Pour cette étape, il est préférable de porter des lunettes et un masque de respiration simples de protection personnelle. Agiter avec un agitateur magnétique brièvement dans la hotte et couvrir le bécher avec le clinquant. Puis transférer le gobelet de papier recouvert d’une chambre froide et remuer avec un agitateur magnétique pendant une nuit à 4 ° C. Transférer l’homogénat pour centrifuger rotor bouteilles (contenants de 250 mL) et centrifugeuse dans un rotor à angle fixe à 4 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Sous une hotte chimique, récupérer le surnageant et le filtre à travers les 4 couches d’étamine. Diviser l’homogénat parmi les tubes à centrifuger en polypropylène mL 38,5 et centrifuger pendant 2,5 h à 40 000 x g à 4 ° C. En général, recherchez la présence d’une pastille verte en bas du tube et une pastille blanche sur toute la longueur du tube. Décanter le liquide surnageant et conserver les deux pastilles ; Placer les échantillons sur la glace.Remarque : La pastille verte contient les chloroplastes, amidon et autres organites. Travailler sous une hotte chimique, utilisez une spatule en caoutchouc pour séparer les pellets. Resuspendre le culot blanc dans chaque bouteille de rotor dans 1 mL de ddH2O au cours des 1-2 h tout en conservant que les suspensions pour la nuit à 4 ° C pour permettre les matériaux se dissoudre complètement dans la solution. Centrifuger la suspension à 6 000 x g et à 4 ° C pendant 10 min enlever les débris restants. Centrifuger la suspension concentrée à 136 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour granuler des virions. Remettre les boulettes dans 1 mL de tampon (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2).Remarque : Une étape facultative est de traiter des virions à la DNAse I (10 µg/mL) pour 10 min à 37 ° C pour éliminer l’ADN non-encapsidés, c’est-à-dire, contamination des chloroplastes et ADN mitochondrial. Puis, inactiver la DNAse I en ajoutant EDTA 1 mM. Perturber des virions 40 µl de 2 µg/µL de protéinase K à 37 ° C pendant 15 min. Travailler à l’intérieur d’une hotte chimique pour récupérer l’ADN virion par extraction organique. Porter un écran facial, des gants et un manteau de laboratoire lors de l’extraction de protection contre les éventuels effets aigus. Ajouter 1 volume d’alcool isoamylique-phénol-chloroforme (49:50:1) dans l’échantillon et agiter à la main pendant 20 s. Centrifuger à température ambiante pour 5 min à 16 000 x g. éliminer la phase aqueuse supérieure et le transfert dans un nouveau tube. Répéter cette extraction deux ou plusieurs fois. Éliminer la phase organique en le plaçant dans une bouteille en verre des déchets pour élimination chimique institutionnelle appropriée26. Concentrer l’ADN à l’aide de la précipitation d’éthanol. Utiliser la concentration finale de 0,3 M d’acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 95 %. Placer les échantillons à-20 ° C pendant 30-60 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 10-20 min granuler les ADN26. Travaillant à un banc de laboratoire, resuspendre le culot d’ADN dans 1 mL de tampon de TE de 0,1 mM (pH 8,0). Filer la suspension à travers une colonne de filtration gel commercial (normalement utilisée pour l’amplification génique (PCR), nettoyage) pour éliminer les sels et les matériaux de faible poids moléculaire qui pourrait entraver la NGS. Analyse des échantillons par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %, en utilisant du bromure d’éthidium coloration pour voir la qualité des préparations. Évaluer la qualité de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre nanodrop.NOTE : Un rapport de l’absorbance d’échantillon à λ 260 et 280 λ entre 1,85 et 2.0 indique en général que la préparation est « propre » d’impuretés et de la qualité voulue. Analyser la qualité de l’ADN (utiliser 5 pg à 10 ng) à l’aide d’une puce basé instrument de l’électrophorèse capillaire.NOTE : Sortie de qualité montre propres pics, représentant des fragments d’ADN distribués par taille le long d’un axe des abscisses. Hauteur des pics indique l’abondance du fragment. Pics indiquent les fragments partiellement dégradés ou contaminants chimiques. Courbes rondes représentent un frottis de l’ADN, ce qui indique de mauvaise qualité 2. Bibliothèque préparation Using DNA et base d’émulsion de Amplification clonale (emPCR Amplification) Note : La bibliothèque est généralement établie par un établissement de NGS qui effectue des travaux axés sur le client. Une solution d’ADN (> 200 ng) à l’aide d’un nébuliseur qui convertit l’ADN en fragments de cisaillement. Ligaturer les cartes commerciales selon d’instructions27 le manuel. Procéder à l’amplification de l’échantillon d’ADN selon instructions28,29,30 les directives du fabricantemPCR. Répétez l’étape de laver trois fois et après chaque lavage, granule perles dans un minicentrifuge de 10 s. jeter le surnageant après chaque lavage.Remarque : La procédure débute par la préparation des perles capture par lavage dans le tampon de lavage commercial fourni avec le kit. emPCR est couramment utilisé pour l’amplification du modèle pour NGS. Chaleur dénaturer l’ADN ou ARN à 95 ° C pendant 2 minutes et ensuite à 4 ° C jusqu’au moment de l’utiliser. Utiliser 200 millions de molécules d’ADN/ARN à 5 millions de capture des perles dans un volume final de 30 µL. préparent un échantillon simulé aux côtés de l’échantillon d’ADN/ARN et exécuter les étapes suivantes avec l’échantillon d’acides nucléiques ainsi que l’échantillon simulé. Effectuer l’émulsification au vortex le tube d’huile émulsion pour 10 s à la vitesse maximale puis versez tout le contenu (4 mL) dans une matière plastique en remuant le tube qui est compatible avec un homogénéisateur de plate-forme. Placer le tube vibrant sur la plate-forme de mélanger l’émulsion à 2 000 tr/min pendant 5 min. Déposer 100 µL d’extraits d’émulsion dans des tubes 8-bande ou dans une plaque de 96 puits. Boucher les tubes ou sceller la plaque et réaliser des emPCR à l’aide recommandé programme28 du fabricant.Remarque : Après que la PCR est terminé, vérifier des puits pour voir si elle est intacte et puis procéder. Jeter le tout bien si elle est cassée. Porter une blouse de laboratoire et travailler sous une hotte chimique pour recueillir les perles d’ADN amplifiés (ADB). Aspirateur aspirer l’émulsion des puits et collecter les perles dans un tube de 50 mL. Rincer les puits deux fois avec 100 µL d’isopropanol et aspirer le rinçage pour le même tube de 50 mL. Vortex la collecte des émulsions et remettre en suspension l’ADB avec de l’isopropanol à un volume final de 35 mL. Granulés de la Bad à 930 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ajouter 10 mL de tampon de renforcer. Vortex la BAsD et puis lavage en ajoutant l’isopropanol à volume final 40 mL Centrifugeuse et jeter le surnageant après chaque lavage et répétez l’étape de lavage deux fois. Effectuer un lavage final à l’éthanol à la place de l’isopropanol. Ajouter améliorant le tampon au volume final de 35 mL, vortex et pellet les perles à 930 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant mais laisser 2 mL de tampon de renforcer. Transférer la suspension dans un tube de microcentrifuge et centrifuger brièvement pour la Bad a granulé. Après avoir jeté le surnageant, rincez le culot ADB deux fois avec 1 mL de tampon de renforcement. Centrifuger et éliminer le surnageant après chaque lavage. Pour parer à l’enrichissement de perle de bibliothèque ADN, ajouter 1 mL de NaOH N 1 aux talons. Vortex la BAsD et puis incuber pendant 2 min à température ambiante. Centrifuger et éliminer le surnageant. Répéter une fois cette étape de lavage. Ajouter 1 mL de tampon de recuit, puis vortex la BAsD et incuber pendant 2 min à température ambiante. Brièvement, centrifuger et éliminer le surnageant. Répétez cette opération à l’aide de 100 µL de tampon de recuit. Pour recuire les amorces de séquençage de l’ADN, ajouter 15 µL de Seq Primer A et 15 µL de Seq Primer B fourni dans le kit. Brièvement, mélanger au vortex et placer le tube de microcentrifuge dans un bloc chauffant à 65 ° C pendant 5 min. transfert de la glace pendant 2 min. Laver trois fois avec 1,0 mL de tampon de recuit. Vortexer pendant 5 s et jeter le surnageant de chaque fois. Avant de séquençage, mesurer le nombre de perles à l’aide d’un comptoir commercial de perle. Il devrait y avoir au moins 500 000 perles enrichis.Remarque : Le compteur de la perle est un appareil spécial qui mesure les billes dans un tube de microcentrifuge fourni. 3. général ARNm isolement et dsDNA synthèse commençant par Canna infectés qui testent les feuilles par RT-PCR pour CaYMV des amorces diagnostique de signalés à l’aide Porter un manteau de laboratoire et des gants de latex pour la protection personnelle dans toutes les étapes subséquentes. Sur un banc de laboratoire, recueille 12 échantillons de feuilles et plongez les échantillons dans l’azote liquide. Utiliser un moulin à billes pour l’homogénéisation. Utilisez une trousse commerciale qui fournit une méthode basée sur les colonnes standard pour l’ensemble des installations ARN. Ajouter le tampon de lyse de guanidine-isothiocyanate fourni par le kit à l’échantillon broyé et agiter pendant 20 s. Ajouter de l’éthanol et mélanger soigneusement, selon les instructions du kit. Chaque homogénat s’ajoute une colonne qui lie RNA à la membrane. Laver trois fois, puis éluer l’ARN dans un tube de récupération24. Quantifier l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre pour mesurer le rapport de l’absorbance à λ 260 et 280 λ. intégrité de vérifier l’ARN en utilisant 1 % électrophorèse sur gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium.NOTE : Un rapport d’absorbance entre 1,85 et 2.0 indique que la préparation est de la qualité voulue. Traiter les ARN à la DNase I (10 µg/mL) pendant 10 min à 37 ° C. Utiliser une colonne commercial concentrer RNA dans de l’eau exempte de RNase31. Échantillons de piscine RNA avant de continuer. Utilisez un kit de désinstallation de rRNA pour supprimer plante ARN ribosomique. Aliquotes billes magnétiques pour les tubes de microcentrifuge et laver deux fois avec RNase-libre de l’eau. Vortex le tube aliquot de resuspendre, placer le tube sur un support magnétique et attendre que le liquide s’effacer. Jeter le surnageant et remplacez-la par la solution de remise en suspension des billes magnétiques. Vortex pour remettre en suspension puis ajouter 1 µL d’inhibiteur de RNase.Remarque : Ces kits utilisent des oligo-dT lié à billes magnétiques qui s’hybrident à l’ARNm. La méthode utilise la technologie de séparation standard aimant perle pour récupérer les relevés24. Mélanger 500 ng à 1,25 µg d’ARN, l’eau exempte de RNase et réaction tampons fournis par le kit. Placer le mélange pendant 10 min à 50 ° C. Retirer du feu et ajouter des billes magnétiques lavés dans l’eau libre de RNAse. Vortex brièvement et ensemble à température ambiante pendant 5 min. Placer sur un support magnétique et attendre que le liquide à effacer. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifuge fraîches. Situé sur la glace. Utiliser une méthode axée sur la solution de capture pour l’enrichissement des exosomes et 200 ng d’ARN pour préparer l’ADNc.NOTE : L’ADNc double brin est généralement établie par un établissement de NGS qui effectue des travaux axés sur le client. Des fragments de l’ARN à l’aide d’une solution commerciale de fragmentation des RNA (0,136 g ZnCl2 et 100 mM Tris-HCl pH 7,0). Ajouter 2 µL de solution à 18 µL d’ARN (total de 200 ng). Tubes de spin brièvement dans la microcentrifugeuse, placer les échantillons à 70 ° C pendant 30 s et le transfert à la glace. Arrêter la réaction en utilisant 2 µL de 0,5 M EDTA pH 8.0 et 28 µL de 10 millimètres de Tris-HCl pH 7,5. Liaison ARN pour billes magnétiques par le mélange à température ambiante pendant 10 min. Utilisez un concentrateur magnétique pour collecter les perles et éliminer le surnageant. Laver les perles trois fois avec 200 µL d’éthanol à 70 %. Jeter chaque laver et sécher ensuite à l’air les granulés perles à température ambiante pendant 3 min. resuspendre dans 19 µL de 10 millimètres de Tris-HCl pH 7,5. Recuire les amorces aléatoires à l’ARN fragmenté par chauffage à 70 ° C pendant 10 min et ensuite placer le tube sur la glace pour 2 min. Préparez le premier brin et deuxième cDNA de brin à l’aide d’un kit de synthèse de cDNA commercial standard. Purifier l’ADNc double brin à l’aide d’un concentrateur de billes magnétiques. Laver avec 800 µL d’éthanol 70 % trois fois. Jeter chaque laver et sécher à l’air les pellets à température ambiante pendant 3 min. resuspendre dans 16 µL de 10 millimètres de Tris-HCl pH 7,5. Utilisez le concentrateur de billes magnétiques pour séparer les perles de l’ADNc double brin, qui est maintenant en solution. Retirez le cDNA en pipettant également, dans un nouveau tube PCR de 200 µL. Procéder à la réparation de fin de fragment à l’aide de la Taq polymérase et un mélange de désoxyribonucléotides fournies par un kit de préparation commerciale de bibliothèque. La trousse commerciale fournit des adaptateurs préalablement dilués à ajouter à chaque extrémité de l’ADNc double brin à l’aide de ligase commercial à 25 ° C pendant 10 min. 4. l’end d’ADN bibliothèque préparé de préparation brute de Virus et anti-ADNdb bibliothèque préparé à partir d’ARNm Utiliser un instrument de pyrosequencing standard à haut débit et suivre des protocoles des constructeurs tous les recommandés pour générer l’affichage direct des séquences d’ADN. Utiliser des réactifs de séquençage commerciale, y compris les nucléotides fluorescent étiquetés.Remarque : Pour les détails voir les instructions du fabricant fournies avec l’appareil. Procéder à l’analyse après séquençage du génome Assemblée logiciel qui assemble automatiquement les lectures pour produire la première série de contigs avec une longueur moyenne de < 700 BP. utiliser le logiciel de FastQC sur le site iPlant/CyVerse qui effectue le contrôle de la qualité contrôles sur les données de séquence brute32. Sélectionner les séquences avec Phred scores ≥ 30 pour continuer à reconstruire des séquences plus longues de plus petite séquence lectures24 à l’aide de la cartographie et logiciel de l’amplicon.Remarque : Pour les détails voir instructions du fabricant. Soumettre ces contigs assemblés à NCBI-BLASTn analyse à l’aide du module par défaut MEGABLAST ainsi que Viridplantae (TaxID : 33090) et virus (TaxID : 10239) en le limitant organismique noms de33. Recueillir la sous-population des contigs qui montrent la forte similarité aux génomes de virus signalés dans le rapport. Vérifiez que les échafaudages jointes qui représentent un ou plusieurs génomes de virus du candidat, produire correctement dans le cadre des séquences qui ont la même organisation que le génome du virus standard. Pour ce faire, entrez le génome du virus pleine longueur de candidat dans un plasmide, logiciel de dessin. Ensuite, confirmez les 15 premiers nucléotides se compose d’un ARNtse sont réunis (TGGTATCAGAGCGAG) qui sont hautement conservée chez les badnaviruses. Localiser le signal de polyadénylation potentiel près de l’extrémité 3′ du génome. Annoter le génome complet afin d’identifier la présence de deux petits ORFs et un grand ORF codant une polyprotéine. Puis utilisez le portail ExPASy traduire outil pour identifier le virus ORF1, ORF2 et ORF3 traduction produits34.Remarque : Ce logiciel scientifique est libre et va générer l’ADN circulaire, identifier lecture ouverte tous les cadres et fournit une sortie immédiate pour vérifier que la séquence représente le génome d’ADN circulaire de pleine longueur. Utiliser open source plusieurs outils de comparaison de séquence, MUSCLE et CLUSTALW, pour comparer les génomes de virus obtenus à partir de35,analyses ADN et l’ARN36. Rechercher la base de données de séquences de nucléotides NCBI pour obtenir les séquences du génome complet du 30 virus espèces et de les exporter dans un document au format .fasta. Télécharger des séquences d’un logiciel qui effectue une analyse génétique évolutive des séquences ainsi que les séquences de génome de virus obtenus par NGS. Générer plusieurs alignements de séquences et les arbres de probabilité Maximum à l’aide de MUSCLE37. 5. qualité évaluation du séquençage De Novo par Amplification par PCR du Virus génomes de plantes infectées Les séquences du génome connu pleine longueur nouvellement identifiés (format .fasta) dans l’outil en ligne gratuit de Primer3 pour dériver des amorces PCR38de l’entrée. Identifier les paires d’amorces qui produiront des produits décalés de 1 000-1 500 PB sur toute la longueur de l’analyses de virus. Envoyer les séquences en réparation qui synthétisent et livrer des amorces de PCR.Remarque : La sortie identifie des paires d’amorces acceptable avec des températures de fusion courantes et acceptables et endroits précis amorce le long les séquences introduites. Travaillant sur un banc de laboratoire et de porter une blouse et des gants, isoler 5 µg d’ADN avec les feuilles de contrôle sains et infectés par le virus à l’aide d’une méthode automatisée qui implique des particules de cellulose paramagnétiques standard pour isoler l’ADN de matière végétale39 . Le gel matériel foliaire (20-40 mg) dans l’azote liquide dans un tube de microcentrifuge et broyer à l’aide d’un moulin à billes. Mélanger l’échantillon avec tampon de lyse dans un tube de microcentrifuge et ajouter RNase A à chaque échantillon. Vortex de l’échantillon pour 10-20 s et brièvement tourner l’échantillon pour éliminer les particules solides.NOTE : Particules de cellulose paramagnétiques ont la grande capacité de liaison à l’ADN et d’isoler des rendements élevés de l’ADN pur. Les méthodes de colonne de silice commerciale standard pour l’isolement de l’ADN extraire pas efficacement l’ADN d’une grande variété d’espèces végétales. En conséquence, des dizaines de méthodes existent qui sont des modifications de ces procédures pour améliorer l’efficacité pour des espèces végétales. La méthode de particules de cellulose paramagnétique automatisé a été choisie parce qu’il donne plus et de meilleure qualité ADN de plus de 25 herbacée angiosperme espèces40. Utilisez des cartouches de réactif commercial pour l’isolement d’ADN paramagnétique automatisé. Ajouter 300 µL d’eau libre nucléase à chaque commercial réactif cartouche et transfert usine de lysat pour la même cartouche. Placez la cartouche dans le panier de la cartouche, placez un piston dans le puits le plus près possible au tube d’élution et placez le tampon d’élution dans le tube d’élution. Charger les cartouches dans la machine d’isolement automatisée des acides nucléiques et exploiter l’usine ADN isolement protocole41,,42. Réaliser la PCR pour calculer un ensemble de produits PCR qui se chevauchent. Utilisez 5 µM de chaque amorce avant et arrière avec 35 cycles d’amplification PCR. Utiliser les conditions suivantes de cyclisme : dénaturation à 95 ° C pendant 60 s, recuit à 50 ° C pour 45 s et l’extension à 72 ° C pendant 1 à 2 min avec une extension finale à 72 ° C pour les 7-10 min. utiliser une colonne de filtration préemballés gel pour éliminer les sels et matériel de faible poids moléculaire comme à l’étape 1.231. Calculer un ratio de 3:1 molaire du produit PCR à vector pour déterminer le montant du produit PCR à ligaturer à 50 ng de plasmide linéarisé pGEM43. Utilisez un control insérer l’ADN afin de déterminer si les trompes fonctionnent efficacement. Effectuer la ligature du jour au lendemain à l’aide de T4 DNA ligase (3 U/µL) à 4 ° C. Puis transform préparé commercialement compétentes JM109 Escherichia coli cellules. Utilisation commande 100 pg d’ADN de plasmide non circonci comme témoin positif pour transformation efficace. Plaque de 100 µL de cellules transformées sur plaques de gélose LB avec sélection antibiotique et bleu/blanc pour récupérer des plasmides ligaturé26. Incuber les boîtes pendant 16 à 24 heures à 37 ° C.Remarque : Le vecteur pGEM possède un gène lacZ qui code pour la β-galactosidase. Les bactéries transformées cultivées sur une plaque contenant de l’ampicilline 100 µg/mL, 0,5 mM IPTG, 80 µg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) sera vire au bleu en raison de l’activité β-galactosidase. Le plasmide pGEM est linéarisé dans une manière qui perturbe le gène lacZ . Les colonies qui contiennent les inserts de produit PCR perturbent le gène lacZ et ne pas métaboliser X-gal. Ces colonies sont blanches. Ainsi les colonies avec un insert peuvent être différenciées de celles sans une insertion par la couleur de la colonie (blanc contre bleu)26. Isoler l’ADN de trois colonies au moyen d’une norme basée sur les colonnes plasmide isolation kit39. Séquence de trois plasmides de produit de transformation. Comparer chaque séquence de l’ADN avec les génomes de virus de novo assemblé produites par NGS. Utilisez CLUSTALW pour aligner les séquences et pour s’assurer qu’ils sont classés en conséquence.

Representative Results

Cette méthode de purification mis à jour le virus fourni un enrichissement du virus ADN utile pour l’identification de deux espèces de virus de la NGS et bio-informatique. Après que l’homogénat est centrifugée à 40 000 x g pendant 2,5 h, il y avait une pastille verte en bas du tube et une pastille blanche sur toute la longueur. La pastille verte a été remis en suspension dans un des tubes de microcentrifuge et la pastille blanche a été resuspendue dans deux tubes de microcentrifuge. PCR a été réalisée à l’aide des amorces de diagnostic CaYMV PCR standards, et les produits ont été détectées dans la pastille blanche solubilisée et pas la pastille verte (Figure 1A). Un échantillon de la préparation brute a été examiné par microscopie électronique à transmission et nous avons observé des particules bacilliformes mesurant 124-133 nm de longueur (Figure 1B). C’est dans la longueur modale prédite de la plupart des badnaviruses. ADN a été extraite des granulés verts et blancs et resuspendue séparément. Dans la Figure 1C, nous chargions 5 µL d’ADN extrait du vert et blanc pastille échantillon (1,6 µg d’ADN pour la fraction verte) et 3,1 µg d’ADN pour la fraction blanche à 0,8 % d’agarose électrophorèse sur gel et analysé l’ADN après le bromure d’éthidium la coloration. La fraction verte contient de faible poids moléculaire ADN tandis que la fraction blanche produit deux bandes d’ADN de poids moléculaire plus élevé, ainsi que le faible poids moléculaire ADN (Figure 1C). Le gel présenté dans la Figure 1C a été exécuté pendant 40 min à 100 V et le frottis sur voie 3 suggère que la tension de gel devrait être abaissée pour produire des bandes plus claires. Ces données suggèrent que la pastille blanche s’est enrichie des virions. La concentration d’ADN (0,6 µg/mL) extraite de l’échantillon blanc était faible, mais suffisante pour NGS, qui exige un minimum de 10 ng d’ADN pour aller de l’avant. L’ADN fragmenté servaient à préparer une bibliothèque pour NGS. En parallèle, l’ARN a été extrait de plantes infectées canna (Figure 1D) pour le haut débit RNA-Seq. Un flux de travail standard a été réalisée pour la préparation de la bibliothèque, NGS, créant des contigs et identifier les séquences du génome viral (Figure 1E). A comparé les résultats de sortie d’utiliser l’ADN et l’ARN comme matières premières. Nous avons obtenu 188 626 lectures brutes d’ADN par NGS en utilisant l’ADN isolé de la préparation de virus brut. Lectures ont été assemblés en contigs 13 269 et BLASTn a été utilisée pour rechercher le dataset NCBI de séquences nucléotidiques (à l’aide de Viridplantae TaxID : 33090 et Virus TaxID : 10239 comme les limitation des organismes) (Figure 1E). Les résultats de NCBI-BLASTn ont révélé que 93 % des contigs de novo assemblés étaient des séquences cellulaires, 22 % étaient inconnus, et 0,3 % contigs de virus (Figure 2A). La majorité des contigs classés en tant que séquences cellulaires ont été identifiées comme mitochondriale ou ADN chloroplastique. Au sein de l’ensemble de données de virus contigs, 32 % de la contigs de virus étaient liés aux membres de Caulimoviridae (qui n’étaient pas différents des séquences) et 58 % d’entre eux étaient liés à virus. Le virus contigs, 29 % étaient très similaires (e < 1 x 10-30) à CaYMV, isolat V17 ORF3 gène (EF189148.1), isoler les virus bacilliformes canne à sucre D Batavia, génome complet (FJ439817.1), et virus de la striure CA banane complète du génome ( KJ013511). Au sein de cette population, il y avait des contigs longs qui ressemblait à deux génomes de pleine longueur. Haut débit RNA-seq produit séquence individuels nettoyés 153 488 lectures avec une moyenne de longueur de < 500 BP. Assemblée Contig de lire ceci réduit à 8 243 contigs. Ceux-ci ont été soumis au NCBI-BLASTn (à l’aide de Viridplantae TaxID : 33090 et Virus TaxID : 10239 comme les limitation des organismes) et les sorties placées 76 % de la contigs dans la catégorie des séquences de cellulaires végétales, 23 % étaient inconnus, et 0,1 % ont été classés en tant que virus contigs () Figure 2 B). un examen plus attentif de la population de la population de 0,1 % des virus contigs déterminé que 68 % d’entre eux ont été assignés à Caulimoviridae (Figure 2B). Trois grandes contigs au sein de cette population ont été identifiés avec forte similarité (e < 1 X 10-30) CaYMV isolat V17 ORF3 gène (EF189148.1), virus de canne à sucre bacilliformes isoler D Batavia, génome complet (FJ439817.1) et Banana streak Virus de CA complète du génome (KJ013511). Examinant les trois contigs, nous avons rejoint manuellement deux d’entre eux pour produire un génome de virus pleine longueur. Nous avons comparé la contigs de longueur de génome de virus produites par le séquençage de l’ADN et l’ARN comme un échafaudage mutuel pour confirmer la présence de deux génomes de virus pleine longueur. Un génome de virus pleine longueur de 6 966 bp a été provisoirement nommé virus de la panachure jaune associée Canna 1 (CaYMAV-1) (Figure 3A). Le génome du deuxième était 7 385 bp et une variante de CaYMV infectant Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Figure 3A). Enfin, des amorces PCR qui visaient à fragment bp clone ~ 1 000 de chaque virus, ont servi à détecter différemment les deux génomes dans une population de 227 plants de canna, représentant neuf variétés commerciales. Dans de nombreux cas, les plantes individuelles étaient infectés par ces deux virus. Nous fournissons un exemple de détection de RT-PCR du CaYMAV-1 et CaYMV-Ap01 dans les 12 usines. Trois d’entre eux ont été positifs que pour CaYMV-Ap01 et neuf étaient positifs pour les deux virus (Figure 3B). Figure 1 : Préparations d’acides nucléiques de virus et de workflow de la NGS. Électrophorèse de 565 fragments PCR de Pb des génomes CaYMV de gel Agarose (A) (1,0 %). Deux produits PCR ont été détectés dans les échantillons préparés à partir de la pastille blanche (pistes 1, 2), mais pas dans l’échantillon de pastille verte (piste 3). Contrôle positif (+) représente un produit PCR amplifié à partir des végétaux infectés ADN qui a été isolé à l’aide d’une méthode automatisée impliquant des particules de cellulose paramagnétiques standard. Lane L contient l’échelle d’ADN utilisé comme un étalon pour mesurer la taille des bandes d’ADN linéaires dans les couloirs de l’échantillon. (B) exemple de particule virale vu par microscopie électronique à transmission dans la pastille blanche récupérée par fractionnement brut des feuilles infectées canna. (C) Agarose (0.8 %) gel électrophorèse d’ADN récupéré du vert (piste 1) et blanc (piste 2) pastilles de ce résultat positif au test par PCR dans Panneau de A. Les points rouges et jaunes à côté de la voie 2 identifient deux bandes d’ADN de haut poids moléculaire qui se produisent dans la fraction blanche. Électrophorèse de l’ARN total récupéré par purification de RNA basée sur les colonnes en gel Agarose (D) (1 %). Lane L contient l’échelle d’ADN utilisé comme un étalon pour mesurer la taille des bandes linéaires dans les couloirs de l’échantillon. Voie 1-6 contient RNA isolé à partir des feuilles de canna infectés qui ont été regroupées sur un seul échantillon de ribo-appauvrissement et pipeline schématique RNA-Seq. (E) de l’isolement de l’acide nucléique, préparation de la bibliothèque, séquençage, contig Assemblée et du génome du virus découverte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Cartes krona visualisant les catégories taxonomiques des contigs. (A) le diagramme sur la gauche montre l’abondance et la distribution taxonomique des contigs assemblés à partir de la préparation de virus brut. Le graphique de droite représente les proportions des contigs de virus associé à la famille des Caulimoviridae , genre connu et trois espèces étroitement apparentées. (B) le panneau sur la gauche montre l’abondance des contigs dérivé de RNA-seq basé sur leur distribution taxonomique. Sur la droite est le graphe représentant l’abondance des contigs au sein de la population des contigs de virus associé à la famille des Caulimoviridae , genre connu et trois espèces étroitement apparentées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 . Caractérisation des génomes CaYMAV-1 et CaYMV-Ap01. (A) Représentation schématique des mottle Canna jaune associé virus 1 (CaYMAV) et le virus de la panachure jaune Canna similaire au génome isolé de Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Positions 1-10 de nucléotides est identifié comme le début du génome et contient un ARNtrencontré anticodon site typique de la plupart des génomes différents. Les positions arrêtez et démarrez pour la traduction de cadre de lecture ouvert (ORF) 1 et 2 sont adjacentes. Ces protéines ont inconnu fonctions. ORF3 est une polyprotéine contenant du doigt de zinc (ZnF), la protéase (Pro), la transcriptase inverse (RT) et domaines de RNAse H. Une séquence de signaux de poly (a) 3′ est conservée pour les deux génomes de virus. (B) analyse par RT-PCR a été réalisée à l’aide d’ARN isolé des feuilles infectées par le virus et des amorces qui détectent les CaYMAV et CaYMV-Ap01. Dans la même population de 12 usines, trois ont été infectés par Ap01-CaYMV seulement, alors que les autres ont été infectées avec CaYMAV et CaYMV-Ap01. (+) indique le contrôle positif et (-) indique le contrôle négatif. Ce chiffre est reproduit/modification de Wijayasekara et al. 24 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ces dernières années, diverses méthodes ont été employées pour étudier la biodiversité des plantes virus dans des environnements naturels incluent enrichissante pour les Pseudo-particules virales (VLP) ou virus spécifiques ARN ou ADN2,3,44, 45,46 . Ces méthodes sont suivies d’une analyse NGS et bioinformatique. L’objectif de cette étude était de trouver l’agent causal d’une maladie commune dans une plante cultivée. La maladie a été signalée pour être le résultat d’un virus inconnu qui contient des particules bacilliformes non enveloppés, et pour lesquels seul un fragment de bp 565 a été cloné47. Cette information ne suffisait pas pour les chercheurs préalables d’assigner hypothétiquement le virus du genre connu au sein de la famille Caulimoviridae. Alors que les précédents rapports émis l’hypothèse que la maladie de marbrure de canna en lis canna était le résultat d’une mosaïque unique, à l’aide de la démarche métagénomique décrite dans cette étude, nous avons déterminé que la maladie était causée par différents provisoire deux espèces24. Ainsi, l’effectif d’utilisent une approche de métagénome pour découvrir l’agent causal d’une maladie est que nous pouvons maintenant identifier les situations où il peut y avoir plus d’une cause.

Notre approche combinant les données de séquençage de l’ADN et l’ARN est approfondie et démontre aussi que les résultats à l’aide de deux approches ont donné des résultats cohérents et ont confirmé la présence de deux virus apparentés. Nous avons utilisé une procédure modifiée pour l’isolement de caulimoviruses et produit un échantillon qui s’est enrichi d’acides nucléiques virus associés et qui ont été protégés au sein de la capside du virus. Un laboratoire de service a été mandatée pour effectuer du séquençage de l’ADN. Le concept essentiel pour le séquençage de novo , c’est que l’ADN polymérase incorpore la fluorescente appelée nucléotides dans un brin d’ADN modèle au cours des cycles séquentiels de synthèse de l’ADN. Les contigs assemblé suivie par NGS ont été présentées dans un workflow de bioinformatic produisant des contigs quelques qui ont été identifiés comme virus contigs. Nouvelle confirmation de virus deux génomes10,24,48,49,50 a été obtenue par le biais de l’analyse bioinformatique des RNA-seq données obtenues par déplétion ribo préparations d’ARN. Un résultat intéressant a été d’apprendre que les populations de séquences récupéré par séquençage de l’ADN et l’ARN fourni des distributions similaires d’acides nucléiques non viraux et virales. Pour le séquençage d’ADN et d’ARN, < 0,5 % des séquences étaient d’origine du virus. Au sein de la population du virus séquences 78-82 % appartenaient à la famille des Caulimoviridae. En comparant les contigs de virus assemblé de séquençage de l’ADN et ARN, nous a confirmé que les deux génomes assemblées ont eu lieu dans les deux ensembles de données.

Un souci d’utilisation seul séquençage de l’ADN pour identifier les génomes de virus nouveaux, c’est que le génome du virus est un ADN circulaire ouvert. Nous avons supposé que les séquences qui se chevauchent de discontinuités dans le génome pourraient présentent des obstacles pour l’assemblage de génome de contigs. Premier examen des résultats du séquençage de l’ADN a révélé deux génomes de virus similaires. Nous avons émis l’hypothèse que ces génomes représentent soit la diversité génétique d’une espèce qui n’a pas été étudiée, ou représentés deux espèces co infectant les mêmes plant24. Par conséquent, l’analyse bioinformatique collective des ensembles de données obtenues par NGS ADN et le séquençage de RNA, a permis la confirmation de la présence de deux génomes de pleine longueur.

Il y a un autre rapport qui a mis au point une autre méthode permettant d’extraire les VLP et acides nucléiques d’homogénats de plantes pour les études de métagénomique, basées sur les procédures pour récupérer l’ADN de virus de mosaïque du chou-fleur (CaMV ; un caulimovirus)3. Cette approche a identifié roman RNA et séquences de virus à ADN chez les plantes non cultivées. Les étapes de la procédure d’isolement caulimovirus utilisée dans cette étude à la découverte de l’agent causal d’une maladie des plantes cultivées sont les mesures calculées pour l’extraction de VLP de plantes infectées naturellement24. Le succès de ces deux méthodes mis à jour le suggère que la procédure-cadre de caulimovirus d’isolement peut-être être un précieux point de départ pour études métagénomique des phytovirus en général.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Recherche a été financée par le centre de l’Oklahoma pour l’avancement de la Science et de technologie appliquée Research Programme Phase II AR 132-053-2 ; et par le ministère de l’Oklahoma de cultures de spécialité Agriculture programme de subventions de recherche. Nous remercions le Dr HongJin Hwang et l’OSU bioinformatique Core Facility, qui était soutenue par des subventions de la NSF (EOS-0132534) et le NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 et 5P20RR15564-03).

Materials

NaH2PO4 Sigma-Aldrich St. Louis MO S5976 Grinding buffer for virus purification
Na2HPO4 Sigma-Aldrich  S0751 Grinding buffer for virus purification
Na2SO3 Thermo-Fisher Waltham, MA 28790 Grinding buffer for virus purification
urea Thermo-Fisher PB169-212 Homogenate extraction 
Triton X-100 Sigma-Aldrich  X-100 Homogenate extraction 
Cheesecloth VWR Radnor, PA 21910-107 Filter homogenate 
Tris  Thermo-Fisher BP152-5 Pellet resuspension& DNA resuspension buffers 
MgCl2 Spectrum, Gardena, CA M1035 Pellet resuspension buffer
EDTA Spectrum E1045 Stops enzyme reactions
Proteinase K Thermo-Fisher 25530 DNA resuspension buffer
phenol:chloroform:isoamylalcohol  Sigma-Aldrich P2069 Dissolve virion proteins
DNAse I Promega M6101 Degrade cellular DNA from extracts
95% ethanol Sigma-Aldrich 6B-100 Virus DNA precipitation
Laboratory blender VWR 58984-030 Grind leaf samples
Floor model ultracentrifuge  &Ti70 rotor Beckman Coulter, Irving TX  A94471 Separation of cellular extracts
Floor model centrifuge and JA-14 rotor Beckman Coulter  369001 Separation of cellular extracts
Magnetic stir plate VWR 75876-022 Mixing urea into samples overnight
Rubber policeman VWR 470104-462 Dissolve virus pellet
 2100 bioanalyzer Instrument Agilent Genomics, Santa Clare, CA G2939BA Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip 5067-1513 Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip 5067-4626 Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer
Nanodrop spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Plant total RNA isolation kit Sigma-Aldrich STRN50-1KT Isolate RNA for RNA-seq
RNase-free water  VWR 10128-514 Resuspension of DNA and RNA for NGS
RNA concentrator spin column Zymo Research, Irvine, CA R1013 Prepare RNA for RNA-seq
rRNA removal kit Illumina, San Diego, CA MRZPL116 Prepare RNA for RNA-seq
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Prepare RNA for RNA-seq
 RNA  enrichment system Roche 7277300001 Prepare RNA for RNA-seq
Agarose  Thermo-Fisher 16500100 Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Ethidium bromide Thermo-Fisher 15585011 Agarose gel staining
pGEM-T +JM109 competent cells Promega, Madison, WI A3610 Clone genome fragments
pFU Taq polymerase Promega M7741 PCR amplify virus genome
dNTPs Promega U1511 PCR amplify virus genome
PCR oligonucleotides IDT, Coralvill, IA Custom order PCR amplify virus genome
Miniprep DNA purification kit Promega A1330 Plasmid DNA purification prior to sequencing
PCR clean-up kit Promega A9281 Prepare PCR products for cloning
pDRAW32 software ACAClone Computer analysis of circular DNA and motifs
MEGA6.0 software MEGA Molecular evolutionary genetics analysis
Primer 3.0 Simgene.com
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit Thermo-Fisher R11490 Fluorometric determination of RNA quantity
GS Junior™ pyrosequencing System Roche 5526337001 Sequencing platform
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) Roche 5996520001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents Roche 5996490001 Reagents for emulsion PCR
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) Roche 5996538001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit Roche 5996511001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr Titanium Sequenicing kit* Roche 5996554001 Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit Roche 5996619001 Sequencing plate with associated reagents and gaskets
IKA Turrax mixer 3646000 Special mixer used with Turrax Tubes
IKA Turrax Tube (specialized mixer) 20003213 Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions
GS Nebulizers Kit Roche 5160570001 Nucleic acid size fractionator for use during library preparations
GS Junior emPCR Bead Counter Roche 05 996 635 001 Library bead counter
GS Junior Bead Deposition Device Roche 05 996 473 001 Holder for Picotiter plate during centrifugation
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices Roche 05 889 103 001 Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation
GS Junior Software Roche 05 996 643 001 Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Run Processor v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS De Novo Assembler v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Reference Mapper v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
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References

  1. Dijkstra, J., Jager, C. P. . Practical Plant Virology : Protocols and Exercises. , (1998).
  2. Roossinck, M. J. Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology. Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).
  3. Melcher, U., et al. Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya. J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).
  4. Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay. Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).
  5. Borah, B. K., et al. Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group. Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).
  6. Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences. Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).
  7. Geering, A. D., et al. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. J Gen Virol. 86, 511-520 (2005).
  8. Kunii, M., et al. Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution. BMC Genomics. 5, 80 (2004).
  9. Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm. Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).
  10. Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species. Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).
  11. Gayral, P., et al. A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus. J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).
  12. Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora. AoB Plants. 2011, 008 (2011).
  13. Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).
  14. Singh, K., Talla, A., Qiu, W. Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs. Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).
  15. Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run. J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).
  16. Kreuze, J. F., et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388 (1), 1-7 (2009).
  17. Zheng, Y., et al. VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs. Virology. 500, 130-138 (2017).
  18. James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).
  19. Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India. Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).
  20. Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2. Virus Res. 238, 29-34 (2017).
  21. BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses. Viruses. 8 (7), (2016).
  22. Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida. Plant Health Progress. , 2-4 (2004).
  23. Zhang, J., et al. Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii. Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).
  24. Wijayasekara, D., et al. Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease. Virus Res. 243, 19-24 (2018).
  25. Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. Caulimovirus isolation and DNA extraction. Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn. , (1989).
  27. Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J Gen Virol. 93, 1853-1868 (2012).
  28. Kanagal-Shamanna, R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).
  29. Getts, D. R., et al. Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages. J Neuroinflammation. 9, 246 (2012).
  30. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  31. . Gel filtration principles and methods. GE Healthcare. , (2010).
  32. Goff, S., et al. The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology. Frontiers in Plant Science. 2, (2011).
  33. Lin, Z., et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets. J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).
  34. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, 597-603 (2012).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5, 113 (2004).
  36. Hung, J. H., Weng, Z. Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).
  37. Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review. Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).
  38. Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
  39. Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191 (2013).
  40. Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
  41. Moeller, J. R., et al. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
  42. Grooms, K. . Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa. , (2015).
  43. Nishimori, A., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. PLoS One. 12 (4), 0174916 (2017).
  44. Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Roossinck, M. J. . Plant Virus Evolution. 1, 27-51 (2008).
  45. Roossinck, M. J. The big unknown: plant virus biodiversity. Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).
  46. Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).
  47. Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. . Plant Health Progress. , (2004).
  48. Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.). Archives of Virology. 153 (12), 2263-2272 (2008).
  49. Harper, G., et al. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).
  50. Muller, E., Sackey, S. Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences. Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).

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Verchot, J., Thapa, A., Wijayasekara, D., Hoyt, P. R. Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes. J. Vis. Exp. (137), e57855, doi:10.3791/57855 (2018).
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