新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

1 コビーらによって標準的な方法を使用して差動遠心分離による一般ウイルス浄化25 まず、病気にかかった植物からの葉の 80-100 g を切るし、200 mL のバッファーを研削を使用して 4 ° C でローカルワ リング ミキサーで挽く (0.5 M NaH2PO4, 0.5 M Na2HPO4 (pH 7.2). 0.5% (w/v) Na2SO3)。実験室のコートおよびこの手順のすべてのステップのための手袋を着用します。 その後、1.0 L ビーカーに磨砕液 (300 mL) を転送します。化学フード内ホモジネートする尿素の 18 g と 10% 非イオン性洗剤 (t10 月 C6H4-(OCH2CH2)9オハイオ) 25 mL を追加します。注: この手順お勧め安全メガネおよび個人的な保護のための簡単な呼吸マスクを着用します。 簡単にフードのマグネチックスターラーで攪拌し、箔とビーカーをカバーします。寒い部屋に覆われて箔ビーカーを転送し、4 ° C で一晩マグネチックスターラーで攪拌 遠心分離機の回転子ボトル (250 mL 容器) と、固定角ロータの 4,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心するホモジネートを転送します。化学の発煙のフード、上澄みと寒冷紗の 4 層を介してフィルターを回復します。 38.5 mL ポリプロピレン製遠心管と 2.5 時間 4 ° C で 40,000 × g で遠心分離機の中で磨砕液を分割します。通常、管の下部に緑餌、チューブの長さに沿って白いペレットの存在を確認します。上清を離れて注ぎ、両方のペレットを保持氷の上にサンプルを配置します。注: 緑のペレットには、葉緑体、澱粉および他の細胞器官が含まれています。 化学フードで働いて、ゴム警官を使って餌を区切ります。懸濁液は一晩ソリューションに完全に溶解するため材料を許可する 4 ° c を維持しながら 1-2 時間にわたって ddH2O の 1 mL にそれぞれのローターのボトルに白いペレットを再懸濁します。6,000 g x と残りの残骸を削除する 10 分のための 4 ° C での懸濁液を遠心します。 遠心分離機のウイルス粒子をペレットへの 4 ° C で 2 時間 136,000 x g で濃厚。バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、5 mM MgCl2) 1 mL にペレットを再懸濁します。注: 省略可能な手順は DNAse とウイルス粒子を扱う、私は非以上 DNA、つまり、葉緑体およびミトコンドリア DNA 汚染することを削除する 37 ° C で 10 分間 (10 μ G/ml)。DNAse を不活性化し、私は 1 mm EDTA を追加します。 15 分の 37 ° C で 2 μ g/μ L プロティナーゼ K の 40 μ L でウイルス粒子を混乱させます。 有機抽出によるウイルス粒子の DNA を回復する化学フード内部の作業します。急性の健康影響に対する保護のため抽出時に研究室コート、手袋、顔面シールドを着用します。サンプルにフェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコール (49:50:1) の 1 ボリュームを追加、16,000 x g に 5 分は上層の水相と新しい管への転送を削除するため、室温で 20 s. 遠心の手で振る。この抽出 2 回以上を繰り返します。制度的化学廃棄26ガラスの廃瓶に置くことで有機相を破棄します。 エタノールの沈殿物を使用して DNA を集中します。0.3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) の最終的な集中を使うと 95% のエタノールの 2.5 倍の量。-20 ° C、30-60 分および DNA26のペレットを 10 ~ 20 分 13,000 × g で遠心分離にサンプルを配置します。 研究室のベンチで働いて、1 mL の 0.1 mM TE バッファー (pH 8.0) で DNA ペレットを再懸濁します。ファイラー (通常使用されるポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のクリーンアップ) 商業ゲルろ過クロマトグラフィによる懸濁液塩と NGS を妨げる可能性がある低分子量物質を除去するために。 エチジウム ブロマイド染色、製剤の品質を表示するのにを使用して 1% アガロースゲル電気泳動によってサンプルを分析します。Nanodrop 分光光度計を用いた DNA の品質を評価します。注: 260 λ および 280 の λ 1.85 と 2.0 の間でサンプルの吸光度の比は、準備が不純物の「クリーン」があり、目的の品質のことに通常を示します。 DNA の品質を分析 (5 pg は 10 を使用 ng) チップを用いたキャピラリー電気泳動装置です。注: 品質の出力は、x 軸に沿ったサイズで配布の DNA のフラグメントを表すクリーンの峰を示しています。ピークの高さは、フラグメントの豊富さを示します。ギザギザのピークを示す部分的劣化フラグメントまたは化学汚染物質。丸い曲線を表す貧しい品質を示す DNA の塗抹 2. ライブラリの準備使用 DNA とエマルジョン系クローン増幅 (emPCR 増幅) 注: ライブラリは、通常お客様指向を貫く NGS 施設で用意しています。 DNA をフラグメントに変換するネブライザーを使用して DNA (> 200 ng) のソリューションをせん断します。マニュアルの手順27によると商業的なアダプターを縛る。 製造元の指示28,29,30によると DNA のサンプルの emPCR 増幅を行います。3 回洗浄手順を繰り返し、各洗浄した後、minicentrifuge のビーズ用ペレット 10 s. 破棄上清各洗浄後。メモ: 手順は、キットに付属商業洗浄バッファーで洗浄によってキャプチャ ビーズの作製と開始します。emPCR は、NGS のテンプレートの増幅に使用されます。 熱変性 DNA または RNA 95 ° C で 2 分をクリックし、使用する準備ができるまで 4 ° C。使用 2 億 30 μ L の最終巻で 500 万キャプチャ ビーズ DNA ・ RNA の分子は、DNA ・ RNA のサンプルとモックのサンプルと同様、核酸サンプルでは、次の手順を行うと並んでモック サンプルを準備します。 ボルテックス 10 のエマルジョン オイルの管によって乳化を実行最大速度で s は、プラスチック製のプラットフォーム ホモジナイザーと互換性のあるチューブを攪拌にコンテンツ全体 (4 mL) を注ぐ。プラットフォーム上で 5 分間 2,000 rpm でエマルジョンをミックスする攪拌チューブを配置します。 8 ストリップ キャップ チューブや 96 ウェルのプレートには、乳剤の 100 μ 因数を調剤します。チューブをキャップ プレート シールや製造元の推奨プログラム28を使用して emPCR を実行します。メモ: PCR の完了後は、乳剤がそのまま進み、井戸を確認します。乳剤が壊れている場合は、全体をしっかりを破棄します。 白衣を着用し、増幅された DNA ビーズ (ADB) を収集するために化学フードで働きます。真空吸引井戸からエマルジョン 50 mL のチューブでビーズを収集しています。イソプロパノールの 100 μ L で 2 回井戸をリンスし、同じ 50 mL のチューブにリンスを吸引します。 収集した渦エマルジョン、35 mL の最終巻をイソプロパノールで ADB を再懸濁します。930 x g で 5 分間削除で ADB の上澄みをペレットし、バッファーを強化 10 mL を加えます。渦 ADB とそれぞれ洗浄し、洗浄ステップを 2 回繰り返して 40 mL 最終巻遠心分離機にイソプロパノールと破棄上清を追加し、洗ってください。 イソプロパノールの代わりにエタノールを使用して最終的な洗浄を行います。追加 35 mL 最終巻、渦、ペレットにバッファーを高める 930 x g で 5 分間でビーズ上澄みを除去が、バッファーを強化 2 mL を残します。 微量遠心チューブに懸濁液を転送し、簡潔に ADB をペレットに遠心分離機します。上清を廃棄後に、1 mL の強化バッファーで 2 回 ADB ペレットをすすいでください。遠心分離機、各洗浄後上澄みを廃棄します。 DNA ライブラリ ビーズ濃縮の準備をするには、ビーズに 1 N NaOH の 1 mL を追加します。渦 ADB とし、室温で 2 分間インキュベートします。遠心し、上清を捨てます。この洗浄手順をもう一度繰り返します。 アニーリング バッファー、渦、ADB の 1 mL を追加し、室温で 2 分間インキュベートします。簡単に遠心し、上清を捨てます。再度アニーリング バッファーの 100 μ L を使用してこの手順を繰り返します。 Dna 配列のプライマーをアニール、Seq プライマー A の 15 μ L と Seq プライマー B キットに付属の 15 μ L を追加します。簡単にボルテックスによってミックスし、65 ° C 5 分 2 分の氷への転送でのヒート ブロックに遠心チューブを配置します。 アニーリング バッファー 1.0 mL で 3 回洗います。5 s と破棄するたびに上清の渦。 シーケンス処理の前に商業ビーズ カウンターを使用してビーズの数を測定します。少なくとも 500,000 の豊かなビーズがあるはずです。注: ビーズ カウンターは、指定された微量遠心チューブにビーズを測定する特殊な装置です。 3. 一般的な mRNA 合成から始まる感染カンナは CaYMV を使用して報告された診断プライマーの RT-PCR 法によりテストする葉 dsDNA の分離と 以降の手順で研究室コートと個人保護用ラテックス手袋を着用します。研究室のベンチで働いて、葉から 12 個の試料を収集し、サンプルを液体窒素に突入します。均質化のビーズ工場を使用します。総植物 RNA の隔離のための標準列ベースの方法を提供する商業キットを使用します。20 の粉砕と手ふれするキットによって提供されるグアニジン イソチオ シアン酸の溶解バッファーを追加 s。 エタノールを加え、キットの指示に従って、徹底的に混ぜます。各の磨砕液を膜に RNA を結合するスピン列に追加します。3 回洗浄し、回収管24に RNA を溶出します。 260 λ と λ 280。 RNA の整合性を検証 1% アガロースゲル電気泳動エチジウム ブロマイドで染色を使用して吸光度の比を測定する分光光度計を使用して RNA を定量化します。注: 1.85 と 2.0 の間の吸光度比は、準備が必要な品質であることを示します。DNase の RNA を扱う私は 37 ° C で 10 分間 (10 μ G/ml)RNase フリー水31で RNA を集中するのに商業回転カラムを使用します。プール RNA サンプルを続行する前にします。 リボソーム RNA の植物を削除するのに削除、rRNA のキットを使用します。微量遠心チューブと洗浄を 2 回に分注の磁気ビーズ RNase フリーと水します。渦管に再懸濁します、分注チューブ マグネット スタンドに、液体をオフに待ちます。上澄みを廃棄し、磁性体粒子の再懸濁のソリューションに置き換え。再懸濁します RNase 阻害剤の 1 μ L を追加し渦。注: このようなキットは、oligo dT mRNA に交配させる磁気ビーズにバインドを使用します。メソッドは、成績証明書24を回復するのに標準マグネット ビーズ分離技術を使用します。 Rna の 1.25 μ g に組み合わせる 500 ng RNase フリー水と反応バッファー キットによって提供されます。50 ° c. で 10 分の混合物を置く暑さから削除し、RNAse フリー水で洗浄の磁気ビーズを追加します。渦を簡単に、5 分間室温で設定します。 マグネット スタンドに配置し、オフに液体を待ちます。新鮮な遠心チューブに上清を転送します。氷の上を設定します。 エクソソームと 200 の濃縮ソリューション ベースのキャプチャ方法を使用して cDNA ライブラリを準備する RNA の ng。注: 二重鎖 cDNA ライブラリ通常仕事の顧客志向を貫く NGS 施設で用意しています。 商業の RNA 断片化ソリューション (0.136 g ZnCl2と 100 ミリメートル トリス塩酸 pH 7.0) を使用して RNA をフラグメントします。18 μ L の RNA 溶液 2 μ L を加える (200 ng の合計)。スピンの遠心で簡単にチューブ、30 s、や氷への転送のための 70 の ° C でサンプルを配置します。2 μ L の 10 mM トリス塩酸 pH 7.5 の 0.5 M EDTA pH 8.0 および 28 μ L を使用して反応を停止します。 10 分の室温で混合することによって磁性ビーズにバインド RNA は、磁気コンセントレーターを使用ビーズを収集し、上清を捨てます。70% エタノール 200 μ L で 3 回ビーズを洗浄します。破棄それぞれ洗浄し、空気が乾燥し、室温 3 分の小球形にされたビーズ 10 mM トリス塩酸 pH 7.5 の 19 μ L で再懸濁します。 70 ° C 10 分の加熱により断片化された RNA にランダムなプライマーをアニールし、2 分準備最初ストランドと標準的な商業 cDNA 合成キットを使用して 2 番目の鎖 cDNA のため氷の上管。 磁気ビーズ コンセントレーターを使用して二重鎖 cDNA を浄化します。3 回 800 μ L の 70% エタノールで洗浄します。破棄それぞれ洗浄し、空気乾燥 3 分間室温でペレットは、10 mM トリス塩酸 pH 7.5 の 16 μ L で再懸濁します。磁気ビーズ コンセントレーターを使用すると、ソリューションにある二本鎖 cDNA からビーズを分離します。新しい 200 μ L の PCR チューブに分注して cDNA を削除します。 Taq のポリメラーゼおよび商業図書館準備キットによって提供されるナノメーターの混合物を使用してフラグメント終わり修理を実施します。市販のキットでは、25 ° C で 10 分間商業リガーゼを使って二重鎖 cDNA の各端に追加する希釈アダプターを提供します。 4. ウイルス製剤と dsDNA mRNA から調製したライブラリから調製した DNA ライブラリの NGS 標準高スループット パイロシークエンス楽器を使用し、DNA 配列の直接読み出しを生成するすべての推奨メーカーのプロトコルに従います。蛍光に分類されたヌクレオチドを含む商業シーケンス試薬を使用します。注記: 詳細は、計測器の製造元の指示を参照してください。 < 700 跪くの平均の長さとコンティグの最初のセットを生成する読み取りを自動的にアセンブルするゲノムのアセンブリのソフトウェアを使用してポスト シーケンス解析を行う品質管理を行なう iPlant/サイヴァース ウェブサイト上の FastQC ソフトウェアを使用します。塩基配列データ32のチェックします。マッピングと私アンプリコン ソフトウェアを使用してより小さいシーケンス読み取り24から長いシーケンスを再構築していく Phred スコア ≥ 30 でシーケンスを選択します。注: 詳細は製造元の指示を参照してください。 NCBI BLASTn 解析メガブラスト デフォルト モジュールとして Viridplantae を使用してこれらの組み立てられたコンティグを提出 (TaxID: 33090) やウイルス (TaxID: 10239)33名制限の個体として。レポートに報告されたBadnavirusのゲノムに高い類似性を示すコンティグの亜種を収集します。 1 つまたは複数の候補フルレングス ウイルスのゲノムを表す結合された足場が正しく標準 badnavirus ゲノムと同じ組織があるフレームのシーケンスを生成することを確認します。これを行うには、ソフトウェアを描画プラスミドに候補全長ウイルスゲノムを入力します。最初 15 のヌクレオチドは、tRNA に会った(TGGTATCAGAGCGAG) を badnaviruses の間で保存性が高いので構成されていますを確認します。ゲノムの 3′ 末端に近い電位起こる信号を検索します。小さな 2 つの Orf と 1 つの大規模な ORF ポリタンパク質をエンコードの存在を確認する完全なゲノムの注釈を付けます。ExPASy ポータルを使用して翻訳 badnavirus ORF1 と ORF2、ORF3 翻訳製品34を識別するツールです。注: この科学的なソフトウェアは無料と、環状 DNA を生成、識別すべて開いたリーディング フレーム、およびシーケンスがフルの長さの円形のゲノム DNA を表すことを確認する即時出力を提供します。 DNA および RNA の解析35,36から得られたウイルスのゲノムを比較するのに複数のシーケンスの比較ツール、筋肉、CLUSTALW、オープン ソースを使用します。 30 badnavirus 種の全ゲノム シーケンスを取得して .fasta 形式のドキュメントとしてエクスポート NCBI 塩基配列データベースを検索します。NGS によって得られたウイルスのゲノム シーケンスと共にシーケンスの進化の遺伝学的解析を行うソフトウェアにシーケンスをアップロードします。複数の配列アラインメントと筋37を使用して最大尤度ツリーを生成します。 5. 感染植物からのウイルスのゲノムの PCR 増幅によるDe Novoシーケンスの評価 PCR プライマー38する無料オンライン Primer3 ツールに新たに同定されたフルレングス badnavirus ゲノム配列 (.fasta 形式) を入力します。ウイルス genome(s) の全体の長さに沿って 1,000-1,500 bp の千鳥生産プライマー セットを識別します。合成、PCR のプライマーを提供サービス施設にシーケンスを送信します。注: 出力は、一般的の溶ける温度と導入されたシーケンスに沿って正確なプライマー場所許容プライマー対を識別します。 研究室のベンチで作業、実験用の上着と手袋を身に着けている、植物素材39から DNA を分離する標準的な常磁性セルロース粒子を含む自動化された方法を使用してウイルス感染および健康な制御の葉から DNA の 5 μ g を分離します。葉材 (20-40 mg) を微量遠心チューブに液体窒素で凍結し、ビーズのミルを使用してを挽きます。微量遠心チューブに換散バッファーのサンプルを組み合わせて、RNase A を各サンプルに追加します。渦サンプル 10-20 s と簡単にスピン固体粒子を削除するサンプルです。注: 常磁性セルロース粒子高 DNA 結合の能力を持っている、純粋な DNA の高収率を隔離します。DNA の隔離のための標準的な商業シリカ カラム法効率的にさまざまな植物種から DNA を抽出しません。その結果、メソッドの数十存在する個々 の植物種の効率を改善する手順の変更です。以上 25 草本被子植物種40より高品質の DNA が得られますので、自動化された常磁性セルロース粒子法が選ばれました。 自動化された常磁性 DNA の隔離のための商業試薬カートリッジを使用します。ヌクレアーゼ フリー水の 300 μ L を各商業試薬カートリッジと転送植物ライセートを同じカートリッジに追加します。カートリッジ ラックには置、溶出チューブに近い井戸のプランジャーに、溶出チューブに溶出バッファーを置きます。核酸自動分離機にカートリッジをロードし、植物 DNA 分離プロトコル41,42を実行します。 重複する PCR の製品のセットを派生する PCR を行います。PCR の拡大のサイクルで 35 各前方および逆のプライマーの 5 μ M を使用します。次のサイクリング条件を使用: 95 ° C、60 s、7 ~ 10 分除去するためにパッケージ化されたゲルろ過カラムを使用塩の 45 s、および 72 ° C で最終的な拡張と 72 ° C 1-2 分で延長は 50 ° C で熱処理、低分子材料で変性 ステップ 1.231。 50 に縛ること PCR の製品の量を決定するベクトルに PCR の製品の 3:1 のモル比を計算する線形 pGEM プラスミド43の ng。コントロール挿入 DNA およびが効率的に動作するかどうかを決定するために使用します。一晩 4 ° C で T4 DNA リガーゼ (3 U/μ L) を使って結紮を行う変換が商業的 JM109 有能なエシェリヒア属大腸菌を準備し、セル。使用は、効率的な変換のための肯定的な制御としてノーカット プラスミド DNA の 100 pg を制御します。LB 寒天培地プレート上に変換されたセルの 100 μ L をプレート結紮プラスミド26を回復する抗生物質と青/白で。37 ° C で 16-24 h 用の版を孵化させなさいメモ: pGEM ベクトル β-ガラクトシダーゼをコードする lacZ 遺伝子があります。変換された細菌が平板上に成長した 100 μ g/mL アンピシリン、0.5 mM IPTG、80 μ g/mL 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase を含む (X-gal) が青く β-ガラクトシダーゼ活性のためなります。LacZ遺伝子を混乱させる方法で pGEM プラスミドが線形化されます。PCR の製品の挿入を含む植民地は lacZ の遺伝子を妨害し、X gal を代謝されません。これらの植民地は白されています。こうして植民地 (青と白)26の色によって、挿入なしでそれらから挿入して植民地を区別できます。 標準列に基づくプラスミド分離キット39を使用して 3 つのコロニーからの DNA を分離します。変換製品の 3 つのプラスミドをシーケンスします。NGS のプロデュース・ デ ・ ノボ組み立てウイルス ゲノムと各 DNA シーケンスを比較します。CLUSTALW を使用して、シーケンスを配置し、適切に順序付けられていることを確認します。