Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

1. preparação das células Manter o NAMRU do mouse glândula mamária epiteliais células (NMuMG) com 5 mL de D-MEM contendo 10% (v) fetal de soro bovino (FBS) e 1% (v) penicilina-estreptomicina (P/S) num balão de3 25 cm. Remover Dulbecco modificado médio da águia (D-MEM), contendo 10% FBS e 1% P/S. Adicione 3 a 5 mL de 37 ° C fosfato salino (PBS) (-) no balão. Observe que o pH da PBS é 7,1-7,3. Remova todos a PBS o balão usando um aspirador. Adicione 1,5 mL de tripsina de 37 ° C (0,25%, p/v) ao balão. Incube o frasco por aproximadamente 1-2 minutos a 37 ° C numa incubadora de CO2 . Adicionar 3,5 mL de D-MEM contendo 10% FBS e 1% P/S para o balão. Pipeta para misturar. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifuga-lo por 3 min à temperatura ambiente. Observe que o raio de rotação e a velocidade de rotação do centrifugador são 16,6 cm e 1500 rpm, respectivamente. Sob estas condições, a força centrífuga relativa é 417 x g. Adicionar 5 mL de D-MEM fresco (10% FBS e 1% P/S) para o balão após aspiração do meio (se necessário, cryopreserve as células com solução de criopreservação, seguindo as instruções do fabricante). 2. preparação do Dextran (DEX) Prepare 80 mg/mL de solução DEX, misturando-se 10 mL de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) e 0,8 g de DEX. Observe que a solução DEX pode ser filtrada com um filtro de seringa (0,22 µm) depois que as células têm cultivado por um tempo suficiente. Prepare uma suspensão de células contendo 40 mg/mL de meio de DEX, misturando-se 200 µ l de solução DEX e 200 µ l da suspensão celular preparada no ponto 2.1. Observe que o número densidade de células na solução é de aproximadamente 2,3 × 105 células/mL. 3. preparação para Laser e microscopia Ligue o laser (onda contínua, comprimento de onda de 1.064 nm) (Figura 1um). Observe que o uso de um feixe de laser com um comprimento de onda de vermelho a região infravermelha é mais eficaz; nesta região de comprimento de onda é chamada a janela de diagnóstico e terapêutica de10 pois é minimamente absorvido pelas células. Clique duas vezes no ícone do software. Clique duas vezes em que ícones para a câmera ①, ② diodo emissor de luz (LED), foco ③ ajustar e ④ estágio movente. O exibe correspondente a ①-④ aparecerá (Figura 1b). 4. célula manipulação usando o sistema de captura de Laser Lugar 20 µ l da amostra preparada no passo 2.2 no vidro da tampa do fundo (0,17 mm de espessura, tamanho = 30 mm × 40 mm) e cubra-o com o vidro de tampa superior (0,17 mm de espessura, tamanho = 18 mm × 18 mm), com separação fornecida por dois espaçadores (0,17 mm de espessura tamanho = 10 mm × 24 mm), conforme mostrado na Figura 2. Note que estes óculos não requerem um revestimento especial. Coloque a célula de amostra preparada no passo 4.1 o inferior da lente objetiva (imersão com ca. 10 μl, ampliação de água = 60 X, distância de trabalho = 0,28 mm, abertura numérica = 1,2)). Anexar a lente objetiva superior (imersão com ca. 10 μl, ampliação de água = 60 X, distância de trabalho = 2 mm, abertura numérica = 1.0) na parte superior da célula de amostra. Liga o LED luz clicando no ícone 2 (Figura 1b). Ajustar a distância entre a amostra e a lente objetiva inferior clicando os ícones no painel 3 (Figura 1b) até que esteja em foco. Irradiar os raios laser na posição 1 e 2 de posição (Figura 1B) da amostra clicando em ícones I, II e III (Figura 1b). Defina a intensidade de cada feixe de laser para 1.500 mW inserindo este valor no ícone IV (Figura 1b). Mover o estágio de amostra clicando em direções indicando do ícone 4 (Figura 1b) até uma célula está preso na posição 1 (Figura 1b). Arrastar o cursor indica a posição 2 (Figura 1b) até outra célula está preso na posição 2. 5. construção de uma estrutura de 3-Dimensional (3D) celular Manipule uma única célula, para que fique em contato com outra célula. Manter essa condição para 300 s; ou seja, cada célula é exposta a um laser para 300 s. Grave o eixo de X-Y, mostrado na Figura 1b. Construa um conjunto arbitrário de célula 2D pela captura e transporte de outra célula para as células. Construa um assembly celular 3D movendo-se acima e para baixo do palco. Confirme que a Assembleia permanece estável após o laser é desligado.