מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

1. הכנת תאים לשמור על NAMRU (תאי NMuMG) בתאי אפיתל עטין עכבר עם 5 מ של D-מ המכיל 10% (v) העובר שור סרום (FBS) ו- 1% (v) פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) בבקבוקון3 25 ס מ. של הסרה Dulbecco שונה בינונית של הנשר (D-מ), המכיל 10% FBS ו 1% P/S. להוסיף 3-5 מ ל תמיסת 37 ° C באגירה פוספט (PBS) (-) הבקבוקון. שימו לב כי ה-pH של PBS 7.1-7.3. הסר כל טוב, מגניב. הבקבוק באמצעות של העצמות. להוסיף 1.5 מ של 37 ° C טריפסין (0.25%, w/v) הבקבוקון. תקופת דגירה את הבקבוקון של 1-2 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO. להוסיף מ 3.5 ל D-מ המכיל 10% FBS ו 1% P/S הבקבוקון. פיפטה לערבב. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 מ”ל, centrifuge זה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שימו לב כי רדיוס הסיבוב ומהירות הסיבוב לצנטריפוגה ס”מ 16.6 ו 1500 סל ד, בהתאמה. תחת תנאי זה, הדיסקה היחסי הוא 417 x g. הוסף 5 מ ל D טריים-מ (10% FBS ו 1% P/S) הבקבוקון לאחר כ רפה בעברית המדיום (אם יש צורך, cryopreserve תאי הקפאה קריוגנית פתרון, בעקבות הוראות היצרן). 2. הכנת לתוספי (דקס) הכן 80 מ”ג/מ”ל של דקס פתרון על ידי ערבוב 10 מ”ל של D-מ (10% FBS, 1%P/S) ו- 0.8 גר’ דקס. שימו לב כי ניתן לסנן את הפתרון דקס עם מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר) לאחר התאים יש תרבותי למשך זמן מספיק. להכין השעיה התא המכיל 40 מ”ג/מ”ל דקס בינוני על ידי ערבוב µL 200 בפתרון דקס, 200 µL של התליה תא המבושלות 2.1. שימו לב כי צפיפות מספר של תאים בהפתרון הינו כ 2.3 × 105 תאים למ”ל. 3. הכנה לייזר ומיקרוסקופיה להפעיל את הלייזר (גל רציף, 1,064 באורך גל של nm) (איור 1). שימו לב כי השימוש של קרן לייזר עם אורך גל אדום-סגול אזור הינו היעיל ביותר; אזור באורך גל זה נקרא חלון האבחון והטיפול10 מאז זה נספג מינימלית על ידי התאים. לחץ פעמיים על סמל התוכנה. לחץ פעמיים על שהסמלים עבור המצלמה ①, ② דיודות פולטות אור (LED), מיקוד ③ להתאים ולאחר ④ עובר שלב. מציג המתאים ①-④ יופיע (איור 1b). 4. תא מניפולציה באמצעות מערכת לייזר השמנה מקום 20 µL של המדגם מוכן בשלב 2.2 על הזכוכית המכסה התחתון (0.17 מ מ עובי, גודל = 30 מ”מ × 40 מ”מ), ומכסים אותו עם הזכוכית המכסה העליון (0.17 מ מ עובי, גודל = 18 מ מ × 18 מ מ), עם הפרדה שסופקו על-ידי שני מפרידי (0.17 מ מ עובי גודל = 10 מ”מ × 24 מ”מ), כמוצג באיור2. שימו לב כי המשקפיים האלה אינם מחייבים ציפוי מיוחד. במקום התא מדגם מוכן בשלב 4.1 העדשה המטרה נמוכה (מים טבילה עם ca. 10 μl, הגדלה = 60 X, ומרחק עבודה = 0.28 מ מ, מפתח נומרי = 1.2)). לצרף את העדשה המטרה העליונה (מים טבילה עם ca. 10 μl, הגדלה = 60 X, ומרחק עבודה = 2 מ מ, מפתח נומרי = 1.0) בחלק העליון של התא הדגימה. הפעל את ה-LED אור על-ידי לחיצה על הסמל 2 (איור 1b). להתאים את המרחק בין המדגם העדשה המטרה נמוכה יותר על-ידי לחיצה על הסמלים בלוח 3 (איור 1b) עד שיהיה בפוקוס. להאיר את קרני לייזר עמדה 1 ו- 2 עמדה (איור 1B) של המדגם על ידי לחיצה על סמלים אני II, III (איור 1b). להגדיר את עוצמת הלייזר כל 1,500 מגה-וואט על-ידי הזנת ערך זה על הסמל הרביעי (איור 1b). . מהלך הבמה לדוגמה על-ידי לחיצה על סמל 4 כיוונים אנלוגיים (איור 1b) עד תא נלכד-עמדה 1 (איור 1b). גרור הסמן המציין מיקום 2 (איור 1b) עד תא אחר הוא לכוד-מיקום 2. 5. בניית מבנה תלת-ממדי (3D) תא לטפל תא יחיד כך שיהיה בקשר עם תא אחר. לשמור על מצב זה 300 s; קרי, כל תא הוא נחשף לייזר עבור 300 s. להקליט את ציר X-Y שמוצג באיור 1ב’. לבנות הרכבה תא 2D שרירותי על-ידי לכידה והעברה תא אחר לתאים. לבנות אסיפה סלולרית תלת-ממד על-ידי הזזת השלב למעלה ולמטה. לאשר כי מכלול נשאר יציב, אחרי הלייזר כבוי.