Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

1. Vorbereitung der Zellen Pflegen Sie NAMRU Maus Brustdrüse epitheliale Zellen (NMuMG) mit 5 mL von D-MEM mit 10 % (V) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % (V) Penicillin-Streptomycin (P/S) in einem 25 cm3 Kolben. Entfernen Sie Dulbecco geändert Adlers Medium (D-MEM) mit 10 % FBS und 1 % P/S. Fügen Sie 3-5 mL von 37 ° C Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (-) in den Kolben. Beachten Sie, dass der pH-Wert des PBS 7.1-7.3. Entfernen Sie alle PBS aus der Flasche mit einer Absauganlage. 1,5 mL 37 ° C Trypsin (0,25 %, w/V) in den Kolben hinzugeben. Ca. 1 bis 2 Minuten bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren Sie die Küvette. Fügen Sie 3,5 mL D-MEM mit 10 % FBS und 1 % P/S in den Kolben. Pipette zum Mischen. Die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Beachten Sie, dass die Drehungsradius und die Rotationsgeschwindigkeit der Zentrifuge 16,6 cm bzw. 1500 u/min, betragen. Unter dieser Bedingung ist die relative Zentrifugalkraft 417 X g. Fügen Sie 5 mL frisch D-MEM (10 % FBS und 1 % P/S) in den Kolben nach dem Absaugen des Mediums (ggf. Tiefgefrieren der Zellen mit Kryokonservierung Lösung, nach den Anweisungen des Herstellers). 2. Vorbereitung von Dextran (DEX) Bereiten Sie 80 mg/mL DEX Lösung durch Mischen 10 mL von D-MEM (10 % FBS, 1%P/S) und 0,8 g Dex. Beachten Sie, dass die DEX-Lösung mit einer Spritze Filter (0,22 µm) gefiltert werden kann nach der Zellen für eine ausreichende Zeit kultiviert haben. Bereiten Sie eine Zellsuspension mit 40 mg/mL DEX Medium durch Mischen von DEX Lösung 200 µL und 200 µL Zellsuspension in 2.1 vorbereitet. Beachten Sie, dass die Dichte der Zellen in die Lösung etwa 2,3 × 105 Zellen/mL. 3. Vorbereitung für Laser- und Mikroskopie Schalten Sie den Laser (kontinuierliche Welle, 1.064 nm Wellenlänge) (Abbildung 1(ein). Beachten Sie, dass die Verwendung von einem Laserstrahl mit einer Wellenlänge im roten Nahinfrarot-Region am effektivsten ist; dieser Wellenlängenbereich wird die diagnostische und therapeutische Fenster10 genannt, da es minimal von den Zellen aufgenommen wird. Doppelklicken Sie auf Software. Doppelklicken Sie auf die Symbole für Kamera ①, ② Light Emitting Diode (LED), ③ Fokus einstellen und ④ Bühne bewegen. Die Displays entsprechend ① ④ werden (Abbildung 1b) angezeigt. (4) Zelle Manipulation mit dem Laser-Trapping-System Platz 20 µL der Probe vorbereitet in Schritt 2.2 auf der unteren Abdeckung Glas (0,17 mm Stärke, Größe = 30 mm × 40 mm), und mit dem oberen Deckglas abdecken (0,17 mm Stärke, Größe = 18 mm × 18 mm), mit Trennung von zwei Abstandshalter (0,17 mm Dicke zur Verfügung gestellt Größe = 10 mm × 24 mm), wie in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie, dass diese Gläser keine spezielle Beschichtung benötigen. Legen Sie die Sample-Zelle im Schritt 4.1 auf den unteren Objektiv vorbereitet (Wasser eintauchen mit ca. 10 μl, Vergrößerung = 60 X, Arbeitsabstand = 0,28 mm, numerische Apertur = 1,2)). Befestigen Sie die oberen Objektivlinse (Wasser eintauchen mit ca. 10 μl, Vergrößerung = 60 X, Arbeitsabstand = 2 mm, numerische Apertur = 1.0) am oberen Rand der Sample-Zelle. Schalten Sie die LED Licht durch Anklicken 2 (Abbildung 1b). Stellen Sie den Abstand zwischen der Probe und der unteren Objektiv durch Klicken auf die Symbole auf Platte 3 (Abbildung 1b) bis es im Fokus ist. Die Laserstrahlen auf Position 1 und Position 2 (Abbildung 1B) der Probe durch Klicken auf Symbole I, II und III (Abbildung 1b) zu bestrahlen. Stellen Sie die Intensität der einzelnen Laserstrahl auf 1.500 mW durch Eingabe dieser Value-at-Symbol IV (Abbildung 1b). Umzug der Probentisch, indem Sie auf Symbol 4 zeigt Richtungen (Abbildung 1b) bis eine Zelle an Position 1 (Abbildung 1b) gefangen ist. Ziehen Sie der Cursor auf Position 2 (Abbildung 1b) bis zu einer anderen Zelle an Position 2 gefangen ist. (5) Bau einer 3-dimensionalen (3D) Zelle Struktur Eine einzelne Zelle zu manipulieren, so dass es in Kontakt mit einer anderen Zelle. Dieser Zustand für 300 s; d. h., jede Zelle einem Laser für 300 unterliegt, s. Notieren Sie die X-Y-Achse gezeigt in der Abbildung 1b. Konstruieren Sie eine beliebige 2D Cell Assembly durch Überfüllung und einer anderen Zelle, die Zellen zu transportieren. Konstruieren Sie eine zelluläre 3D-Baugruppe von der Bühne auf und ab bewegt. Bestätigen Sie, dass die Versammlung stabil bleibt, nachdem der Laser abgeschaltet ist.