Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

1. bereiding van cellen Onderhouden NAMRU muis melkklier epitheliale cellen (NMuMG cellen) met 5 mL D-MEM met 10% (v) foetale runderserum (FBS) en 1% (v) penicilline-streptomycine (P/S) in een maatkolf van 25 cm3 . Verwijderen Dulbecco van bewerkt Eagle’s medium (D-MEM), met 10% FBS en 1% P/S. 3-5 mL 37 ° C-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (-) Voeg aan de maatkolf. Merk op dat de pH van PBS 7,1-7.3 is. Verwijder alle de PBS uit de kolf met behulp van een aspirator. Voeg 1,5 mL trypsine van 37 ° C (0,25%, w/v) aan op de maatkolf. Incubeer de kolf gedurende ongeveer 1-2 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 . Voeg 3,5 mL D-MEM met 10% FBS en 1% P/S tot de kolf. Pipetteer te mengen. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL en Centrifugeer het gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Merk op dat de straal van de rotatie en de rotatiesnelheid van de centrifuge 16,6 cm en 1500 rpm, respectievelijk. Onder deze voorwaarde is de relatieve centrifugale kracht 417 x g. Voeg 5 mL van de verse D-MEM (10% FBS en 1% P/S) aan op de maatkolf na aspirating van het medium (indien nodig, cryopreserve de cellen met cryopreservatie oplossing, na instructies van de fabrikant). 2. voorbereiding van Dextran (DEX) Bereiden van 80 mg/mL DEX-oplossing door het mengen van 10 mL van de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) en 0.8 g van DEX. Merk op dat de oplossing van DEX kan worden gefilterd met een spuit filter (0,22 µm) nadat de cellen hebben gekweekt voor een voldoende tijd. Bereid een celsuspensie met 40 mg/mL DEX medium door het mengen van 200 µL van DEX oplossing en 200 µL van de celsuspensie bereid in 2.1. Merk op dat de nummer dichtheid van de cellen in de oplossing ongeveer 2.3 × 10 is5 cellen/mL. 3. voorbereiding van de Laser en microscopie Inschakelen van de laser (continu golven, golflengte van 1,064 nm) (Figuur 1een). Merk op dat het gebruik van een laserstraal, met een golflengte in het rood tot nabij-infrarood regio is het meest effectief; deze golflengte regio heet de diagnostische en therapeutische venster10 aangezien het minimaal wordt geabsorbeerd door de cellen. Dubbelklik op het pictogram software. Dubbelklik op die de pictogrammen voor de ① camera, ② light – emitting diode (LED), ③ focus aanpassen, en ④ fase verplaatsen. De displays overeenkomt met ①-④ verschijnt (Figuur 1b). 4. cel manipulatie met behulp van het lasersysteem overvullen Plaats 20 µL van het monster dat is bereid in stap 2.2 op de bodem cover glas (0,17 mm dikte, grootte = 30 mm × 40 mm), en bedek het met de hoogste dekking glas (0,17 mm dikte, grootte = 18 mm × 18 mm), met scheiding geboden door twee afstandhouders (0,17 mm dikte grootte = 10 mm × 24 mm), zoals afgebeeld in Figuur 2. Merk op dat deze bril niet een speciale coating vereisen. Plaats van de cel van de steekproef bereid in stap 4.1 op de lagere objectief (water onderdompeling met ca. 10 μl, vergroting = 60 X, afstand = 0,28 mm, numerieke diafragma = 1.2)). Bevestig het bovenste objectief (water onderdompeling met ca. 10 μl, vergroting = 60 X, afstand = 2 mm, numerieke diafragma = 1.0) aan de bovenkant van de cel van de steekproef. Zet de LED licht door te klikken op pictogram 2 (Figuur 1b). Pas de afstand tussen het monster en de lagere objectief door te klikken op de pictogrammen op paneel 3 (Figuur 1b) totdat het is in focus. Het bestralen van de laserstralen op positie 1 en positie 2 (Figuur 1B) van het monster door te klikken op pictogrammen I, II en III (Figuur 1b). De intensiteit van elke laserstraal ingesteld op 1.500 mW door het invoeren van deze waarde op pictogram IV (Figuur 1b). Zet de monster fase door te klikken op pictogram 4 aangeeft richtingen (Figuur 1b) tot een cel is gevangen in positie 1 (Figuur 1b). Sleep de cursor positie 2 (Figuur 1b) tot een andere cel aangeeft is gevangen in positie 2. 5. bouw van een 3-dimensionale (3D) celstructuur Manipuleren een eencellige zodat er in contact met een andere cel. Handhaven van deze voorwaarde voor 300 s; dat wil zeggen, elke cel wordt blootgesteld aan een laser voor 300 s. De X-en Y-as weergegeven in Figuur 1bopnemen. Construeer een willekeurige 2D cel vergadering door het vangen en transporteren van een andere cel aan de cellen. Bouw een 3D cellulaire vergadering door het podium op en neer te bewegen. Bevestigen dat de vergadering stabiel blijft na de laser wordt uitgeschakeld.