Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

1. hücre hazırlanması NAMRU fare meme bezi epitel hücreleri (NMuMG) D-MEM içeren (v) fetal Sığır serum (FBS) ve (v) penisilin-streptomisin (P/S) 25 cm3 şişe içinde % 1 5 mL ile bakımını yapar. Kaldır Dulbecco’nın modifiye kartal Orta (D-MEM), FBS ve % 1’i içeren P/S. 37 ° C fosfat tamponlu tuz (PBS) (-) 3-5 mL şişe için ekleyin. PBS pH 7,1-7,3 olduğuna dikkat edin. Tüm PBS bir aspiratör kullanarak balonun kaldırın. 37 ° C tripsin (%0.25, w/v) 1,5 mL şişe için ekleyin. Şişeye CO2 kuluçka 37 ° C’de yaklaşık 1-2 dakika için kuluçkaya. D-MEM FBS ve % 1’i içeren 3,5 mL ekleyin P/S şişeye için. Pipet karıştırmak için. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü aktarmak ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi. Dönme yarıçapı ve santrifüj rotasyon hızı 16.6 cm ve 1500 devir/dakika, sırasıyla olduğunu unutmayın. Bu durum altında göreli merkezkaç kuvveti 417 x g olduğunu. 5 mL taze D-MEM ekleyin ( FBS ve % 1 P/S) için orta aspirating sonra şişeye (cryopreservation çözüm, üreticinin yönergeleri izleyerek hücrelerle gerekirse, cryopreserve). 2. Dextran (DEX) hazırlanması D-MEM 10 mL karıştırılarak 80 mg/mL DEX çözeltisi hazırlamak (% 10 FBS, 1%P/S) ve DEX 0.8 gr. DEX çözüm olan bir şırınga filtre (0,22 µm) filtre uygulanabilir Not hücreleri için yeterli bir süre kültürlü sonra. DEX çözüm 200 µL ve 2.1 hazırlanan hücre süspansiyon 200 µL karıştırılarak 40 mg/mL DEX orta içeren bir hücre süspansiyon hazırlamak. Çözüm hücrelerde sayı yoğunluğu yaklaşık 2.3 × 10 Not5 hücre/mL. 3. lazer ve mikroskopi hazırlık (Sürekli dalga, 1,064 nm dalga boyu) üzerine lazer açın (Şekil 1bir). Bir lazer ışını yakın kızılötesi bölgesi için kırmızı bir dalga boyu ile kullanımını en etkili olduğuna dikkat edin; en az hücreleri tarafından emilir beri bu dalga boyu bölge tanı ve tedavi edici pencere10 denir. Yazılımı simgesini çift tıklatın. ① Kamera, ② ışık yayan diyot (LED), ③ odak için simgeleri ayarlamak çift tıklatmak ve ④ sahne alanı. ①-④ için karşılık gelen görüntüler (Şekil 1bkadar) gösterir. 4. bindirme lazer sistemi kullanarak hücre işleme Yer 20 µL adım 2.2 alt kapak cam üzerinde hazırlanan örnek (0,17 mm kalınlık, boyutu = 30 mm × 40 mm) ve ile üst kapak cam kapak (0,17 mm kalınlık, boyutu = 18 mm × 18 mm), iki çubukları (0,17 mm kalınlığında tarafından sağlanan ayırmalı Boyut = 10 mm × 24 mm), Şekil 2′ de gösterildiği gibi. Not Bu gözlük özel bir kaplama gerektirmez. Adım 4.1 alt objektif Lens üzerinde hazırlanan örnek yerleştirin (su daldırma ile ca. 10 μl, büyütme = 60 X, çalışma mesafesi 0,28 mm, sayısal diyafram = 1,2 =)). Üst objektif lens takmak (su daldırma ile ca. 10 μl, büyütme = 60 X, çalışma mesafesi 2 mm, sayısal diyafram = = 1.0) örnek hücrenin üstündeki. LED ışık 2 (Şekil 1b) simgesini tıklatarak açın. Panelde 3 (resim 1b) simgelerini tıklatarak örnek ve alt objektif lens arasındaki mesafeyi ayarlamak odak olana. Lazer ışınları pozisyon 1 ve pozisyon 2 (Şekil 1B) örnek yanında tıkırtı Simgeler ı, II ve III (Şekil 1b) ışınlatayım. Her lazer ışını yoğunluğunu ayarlamak için 1500 mW simgesinin IV (Şekil 1b) Bu değer girerek. Hareket simgesi 4 gösteren Yön (Şekil 1b) kadar bir hücreyi tıklatarak örnek sahne (Şekil 1b) konum 1’de mahsur kaldı. Sürükle kadar başka bir hücre konumu 2 (Şekil 1b) gösteren imleç konumu 2’de kapana kısılmış. 5. 3 boyutlu (3D) hücre yapısı inşaatı Böylece temas başka bir hücreyi tek bir hücrede işlemek. Bu durum için 300 korumak s; her hücre bir lazer için 300 maruz Yani, s. Şekil 1bgösterilen X-Y ekseni kaydı. Rasgele 2D hücre derleme yakalayarak ve hücreleri başka bir hücreye taşıma oluşturun. Sahne alanı yukarı ve aşağı hareket ettirerek bir 3D hücresel derleme oluşturun. Lazer kapalı sonra derleme istikrarlı kalır onaylayın.