Alta resolución comparación de frecuencias de la conjugación bacteriana
Summary
Con el objetivo de entender el comportamiento de los distintos elementos de ADN conjugativos bacterianos bajo condiciones diferentes, se describe un protocolo para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación, con alta resolución, para estimar cómo eficazmente la bacteria donante inicia verbal.
Abstract
Conjugación bacteriana es un paso importante en la transferencia horizontal de genes de resistencia a los antibióticos a través de un elemento de DNA conjugativos. Profundidad comparaciones de frecuencia verbal bajo diferentes condiciones se requieren para entender cómo se propaga el elemento conjugativos en la naturaleza. Sin embargo, los métodos convencionales para comparar frecuencia de conjugación no son apropiados para comparaciones de profundidad debido al alta fondo causado por la ocurrencia de eventos verbal adicional en la placa selectiva. Hemos reducido con éxito el fondo introduciendo un método número más probable de (proveedores médicos MPN) y una mayor concentración de antibióticos para prevenir la conjugación en medio líquido selectivo. Además, hemos desarrollado un protocolo para estimar la probabilidad de cómo a menudo donantes las células iniciar verbal por clasificar las células donantes solo en piscinas de receptores por célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación. Uso de dos plásmidos, pBP136 y pCAR1, las diferencias en la frecuencia de conjugación en las células de Pseudomonas putida podrían detectarse en medio líquido a diferentes velocidades de agitación. Las frecuencias de iniciación verbal eran más altas para pBP136 que para pCAR1. Con estos resultados, podemos comprender mejor las características de la conjugación de estos dos plásmidos.
Introduction
Conjugación bacteriana de plásmidos conjugativos y elementos genéticos móviles y elementos conjugativos e integrativo (CIEM) es importante para la diseminación horizontal de información genética. Puede promover la adaptación y evolución bacteriana rápida y transmitir genes de multirresistencia1,2. La frecuencia de conjugación puede verse afectada por las proteínas codificadas en los elementos conjugativos para movilización de ADN (MOB) y acoplamiento par formación (MPF), incluyendo el pili sexual, que se clasifica según MOB y MPF tipo3,4, 5. También puede verse afectado por el donante y el recipiente par6 y las condiciones de crecimiento de las células7,8,9,10,11,()12 tasa de crecimiento, densidad celular, superficie sólida o medio líquido, temperatura, disponibilidad de nutrientes y la presencia de cationes). Para entender cómo los elementos conjugativos extensión entre las bacterias, es necesario comparar la frecuencia de conjugación en detalle.
La frecuencia de Conjugación entre donante y receptoras parejas después de aparearse se estima generalmente por los métodos convencionales como sigue. (i) en primer lugar, se cuenta el número de colonias de donante y receptor; (ii) luego, se cuentan las colonias receptoras, que recibió los elementos conjugativos (= transconjugants); (iii) y por último, la frecuencia de conjugación se calcula dividiendo las colonias formando unidades (UFC) de la transconjugants los de la donante o destinatario13. Sin embargo, cuando se utiliza este método, el fondo es alto debido a los acontecimientos verbal adicional que también pueden ocurrir en las placas selectivas para obtener transconjugants cuando la densidad celular alta10. Por lo tanto, es difícil de detectar pequeñas diferencias en la frecuencia (por debajo de una diferencia de 10 veces). Recientemente hemos introducido un método de (MPN) número más probable utilizar medio líquido que contiene una mayor concentración de antibióticos. Este método reduce el fondo al inhibir la conjugación en medio selectivo; así, la frecuencia verbal podría ser estimada con mayor resolución.
Verbal se puede dividir en tres pasos: (1) accesorio de donantes y receptores par (2) Inicio de la transferencia conjugativa y (3) disociación del par14. Durante los pasos (1) y (3), no hay interacción física entre el donante y el receptoras células; por lo tanto, la densidad celular y las condiciones ambientales pueden influir estos pasos, aunque también son importantes las características de la pili del sexo. Paso (2) probablemente está regulada por la expresión de varios genes involucrados en la verbal en respuesta a cambios externos, que podrían ser afectadas por diversas características del plásmido, donante y receptor. Aunque el apego físico o la separación de pares donante-receptor puede ser matemáticamente simulada utilizando una estimación de las células como partículas, debe medirse experimentalmente la frecuencia de paso (2). Ha habido algunos informes sobre observaciones directas de cómo a menudo los donantes pueden iniciar verbal [paso (2)] mediante microscopía de fluorescencia de15,16; sin embargo, estos métodos no son alto rendimiento porque un gran número de células debe controlarse. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método para estimar la probabilidad de la ocurrencia de paso (2) mediante el uso de celular de fluorescencia activada (FACS) de clasificación. Nuestro método se puede aplicar a cualquier plásmido, sin identificación de los genes esenciales para la conjugación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un protocolo de alta resolución para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación bajo diferentes condiciones, utilizando un método MPN para estimar el número de transconjugants. Un paso importante en el protocolo es diluir la mezcla de donante y receptor después de aparearse hasta que no transconjugants crecen. Otro paso es añadiendo altas concentraciones de antibióticos en el medio líquido selectivo para evitar más verbal. Estos procedimientos pueden reducir el fondo causado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. K. Kamachi de Instituto Nacional de enfermedades infecciosas (Japón) para proporcionar pBP136 y Prof. Dr. H. Nojiri de la Universidad de Tokio (Japón) para proporcionar pCAR1. También agradecemos al profesor Dr. Molin Sølen de la Universidad técnica de Dinamarca para proporcionar pJBA28. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI JSPS (números de concesión 15H 05618 y 15KK0278) para MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
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