Haute résolution comparaison des fréquences de la conjugaison bactérienne
Summary
Dans le but de comprendre les comportements des divers éléments d’ADN conjugaison bactériennes dans des conditions différentes, les auteurs décrivent un protocole pour détecter les différences de fréquence de conjugaison, avec une haute résolution, pour estimer l’efficacité avec laquelle la bactérie donneur initie la conjugaison.
Abstract
La conjugaison bactérienne est une étape importante dans le transfert horizontal de gènes de résistance aux antibiotiques par un élément d’ADN conjugatif. Comparaisons approfondies de la fréquence de conjugaison dans des conditions différentes sont nécessaires pour comprendre comment l’élément conjugaison se répand dans la nature. Cependant, les méthodes conventionnelles pour comparer la fréquence de la conjugaison ne conviennent pas pour les comparaisons de profondeur à cause de l’arrière-plan élevé causé par la survenance d’événements de conjugaison supplémentaires sur la gélose sélective. Nous avons réussi à réduire le fond en introduisant une méthode le plus probable (NPP) nombre et une plus forte concentration d’antibiotiques pour prévenir toute nouvelle conjugaison en milieu liquide sélectif. En outre, nous avons développé un protocole pour estimer la probabilité de la façon dont souvent donneur cellules conjugaison initier en triant les cellules du donneur unique dans des pools de bénéficiaires par cellule activée par fluorescence triant (FACS). À l’aide de deux plasmides, pBP136 et pCAR1, les différences de fréquence de conjugaison dans les cellules de Pseudomonas putida pourraient être détectés dans un milieu liquide à différentes vitesses d’agitation. Les fréquences de l’initiation de conjugaison étaient plus élevés pour les pBP136 que pour pCAR1. En utilisant ces résultats, nous pouvons mieux comprendre les fonctionnalités de la conjugaison de ces deux plasmides.
Introduction
La conjugaison bactérienne des éléments génétiques mobiles, les plasmides conjugatifs et éléments intégratives et conjugatifs (Ice) est importante pour la propagation horizontale de l’information génétique. Il peut favoriser l’adaptation et l’évolution bactérienne rapide et transmettre des gènes de résistance multidrogue1,2. La fréquence de conjugaison peut être affectée par les protéines codées sur les éléments de conjugaison pour la mobilisation de l’ADN (MOB) et de la formation de la paire correspondante (MPF), y compris les pili sexuels, qui est classés selon le type de la MOB et MPF3,4, 5. Il peut également être affectée par le donneur et le receveur paire6 ainsi que les conditions de croissance des cellules7,8,9,10,11,(12 taux de croissance, densité cellulaire, surface solide ou liquide, température, la disponibilité des nutriments et la présence de cations). Pour comprendre comment les éléments de conjugaison se propager chez les bactéries, il est nécessaire de comparer la fréquence de la conjugaison en détail.
La fréquence de la conjugaison entre donateurs et bénéficiaires paires après l’accouplement sont généralement estimés par des méthodes conventionnelles comme suit. (i) tout d’abord, le nombre de colonies donneur et receveur est compté ; (ii) ensuite, les colonies destinataires, qui reçoit les éléments de conjugaison (= transconjugants) sont comptés ; (iii) et enfin, la fréquence de conjugaison est calculée en divisant la colonie formant des unités (UFC) de le transconjugants par ceux du donateur ou bénéficiaire13. Toutefois, lorsque vous utilisez cette méthode, le fond est élevé en raison des événements de conjugaison supplémentaire qui peuvent également se produire sur les géloses sélectives permet d’obtenir des transconjugants lorsque la densité cellulaire est élevé10. Par conséquent, il est difficile de détecter de petites différences dans la fréquence (sous une différence de 10 fois). Nous avons récemment introduit une méthode (MPN) numéro plus probable, à l’aide d’un milieu liquide contenant une concentration plus élevée d’antibiotiques. Cette méthode réduit le fond en inhibant plus conjugaison dans un milieu sélectif ; ainsi, la fréquence de conjugaison peut être estimée avec une résolution supérieure.
Conjugaison se divisent en trois étapes : (1) fixation du donateur-bénéficiaire paire (2) l’initiation du transfert conjugatif et (3) la dissociation de la paire14. Au cours des étapes (1) et (3), il y a une interaction physique entre le donneur et les cellules réceptrices ; ainsi, la densité cellulaire et les conditions environnementales peuvent influencer ces étapes, même si les caractéristiques des pili sexuels sont également importants. Étape (2) est probablement régulée par l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la conjugaison en réponse aux changements externes qui pourraient être touchées par les diverses fonctionnalités du plasmide, le donneur et le receveur. Bien que l’attachement physique ou détachement des paires de donateur-bénéficiaire peut être simulé mathématiquement en utilisant une estimation de cellules sous forme de particules, la fréquence de l’étape (2) doit être mesurée expérimentalement. Il y a eu quelques rapports sur des observations directes de la façon dont souvent les donateurs peuvent initier conjugaison [étape (2)] à l’aide de la microscopie de fluorescence15,16; Cependant, ces méthodes ne sont pas haut débit, car un grand nombre de cellules doit être surveillé. Par conséquent, nous avons développé une nouvelle méthode pour estimer la probabilité d’apparition de l’étape (2) à l’aide de la cellule à fluorescence activé triant (FACS). Notre méthode peut être appliquée à n’importe quel plasmide, sans identification des gènes essentiels pour la conjugaison.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un protocole haute résolution pour détecter les différences de fréquence de conjugaison dans des conditions différentes, en utilisant une méthode NPP pour estimer le nombre des transconjugants. Une étape importante dans le protocole est diluer le mélange du donneur et du receveur après l’accouplement jusqu’à ce qu’aucune des transconjugants ne grandir. Une autre étape est l’ajout des concentrations élevées d’antibiotiques dans le milieu liquid sélectif pour empêcher d’autres …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr K. Kamachi de l’Institut National des maladies infectieuses (Japon) prévoyant la fourniture de pCAR1 de pBP136 et Prof. Dr. H. Nojiri, de l’Université de Tokyo (Japon). Nous sommes également reconnaissants à Professor Dr. Molin Sølen de l’Université technique du Danemark pour fournir pJBA28. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (Grant Numbers 15H 05618 et 15KK0278) à MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
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