Высоким разрешением сравнение частот бактериальных спряжение
Summary
С целью понять поведение различных бактериальных сопряженных ДНК элементов в различных условиях, мы описать протокол для выявления различий в частоте спряжение, с высоким разрешением, чтобы оценить, насколько эффективно бактерия доноров инициирует спряжение.
Abstract
Бактериальные спряжение является важным шагом в горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности через элемент сопряженных ДНК. Углубленное сопоставление спряжение частоты в различных условиях требуется понять, как сопряженных элемент распространяется в природе. Однако обычные методы для сравнения частоты спряжение не подходят для углубленного сравнения из-за высокой фон, вызванные возникновение дополнительных спряжение событий на пластину выборочной. Мы успешно снизили фона путем внедрения наиболее вероятный метод чисел (MPN) и более высокую концентрацию антибиотиков для предотвращения дальнейшего сопряжения в селективной жидкой среде. Кроме того мы разработали протокол для оценки вероятности как часто доноров клеток инициировать спряжение сортировки одного донора клеток в получателей пулов активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS). С помощью двух плазмид, pBP136 и pCAR1, различия в спряжение частоты в Pseudomonas putida клетки могут быть обнаружены в жидкой среде с разной скоростью перемешивания. Частоты спряжение посвящения были выше, чем pBP136 для pCAR1. Используя эти результаты, мы можем лучше понять функции сопряжения этих двух плазмид.
Introduction
Бактериальные спряжение мобильных генетических элементов, сопряженных плазмидов и интегративной и сопряженных элементов (ИКЕС) имеет важное значение для горизонтального распространения генетической информации. Это может способствовать быстрой бактериальных эволюции и адаптации и передавать гены множественной лекарственной устойчивости1,2. Спряжение частоты могут быть затронуты белков, закодированных на сопряженных элементы для мобилизации ДНК (MOB) и брачные пары формирования (MPF), включая секс пили, которые классифицируются в зависимости от толпы и МПФ тип3,4, 5. Он может также быть затронуты доноров и получателей помощи пара6 и условий роста (12 )11,10,9,клетки7,8, темпы роста, плотность ячеек, твердую поверхность или жидкой среды, температуры, наличия питательных веществ и присутствие катионов). Чтобы понять, как сопряженных элементы распространения среди бактерий, необходимых для сравнения частоты конъюгации в деталях.
Спряжение частоты между донорами и получателями помощи пар после спаривания обычно оцениваются обычными методами следующим. (i) во-первых учитываются числа доноров и получателей колоний; (ii) затем учитываются получателя колоний, которые получили сопряженных элементы (= трансконъюгантов); (iii) и наконец, спряжение частота рассчитывается путем деления тех доноров и/или получатель13колонии, формирование единиц (CFU) трансконъюгантов. Однако при использовании этого метода, фон высока из-за дополнительных спряжение события, которые также может возникать на избирательное пластин, используемых для получения трансконъюгантов, плотность клеток при высокой10. Таким образом трудно обнаружить небольшие различия в частоте (ниже десятикратного разница). Мы недавно представил наиболее вероятное число (MPN) метод, с помощью жидкой среды, содержащие высокую концентрацию антибиотиков. Этот метод уменьшена фон запрещая дальнейшие конъюгации в селективной среде; Таким образом частота сопряжения можно было бы оценить с более высоким разрешением.
Спряжение можно разделить на три этапа: (1) вложение донор получатель пары (2) начало сопряженных передачи и (3) диссоциации пара14. Во время действия (1) и (3) есть физического взаимодействия между донорами и получателями клетки; Таким образом плотность клеток и условия окружающей среды могут влиять эти шаги, хотя характеристики секса пили также важны. Шаг (2) регулируется скорее всего экспрессию нескольких генов, участвующих в конъюгации в ответ на внешние изменения, которые могут быть затронуты различные черты плазмида, доноров и получателей. Хотя физические вложений или отряд пар донор получатель можно математически моделировать с использованием оценки клеток как частицы, частота шага (2) должна измеряться экспериментально. Там было несколько докладов о прямых наблюдений, как часто доноры могут инициировать спряжение [шаг (2)] с помощью флуоресцентной микроскопии15,16; Однако эти методы не являются высокой пропускной способности, потому что большое количество клеток должны контролироваться. Таким образом мы разработали новый метод для оценки вероятности возникновения шаг (2) с помощью клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS). Наш метод может применяться к любой плазмиды, без идентификации важно генов для сопряжения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем разрешением протокол для выявления различий в частоте спряжения глаголов в различных условиях, с помощью метода MPN оценить количество трансконъюгантов. Один важный шаг в протоколе разбавления смеси доноров и получателей после спаривания до тех пор, пока не транс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р K. Kamachi из Национального института инфекционных болезней (Япония) за предоставление pBP136 и профессор д-р H. Нодзири университета Токио (Япония) для обеспечения pCAR1. Мы признательны также профессор доктор Molin Sølen технического университета Дании за предоставление pJBA28. Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI (номера грантов 15H 05618 и 15KK0278) к MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
