細菌の活用頻度の高解像度の比較
Summary
さまざまな条件の下で様々 な細菌クェン DNA 要素の動作を理解することを目的と活用頻度、どのように効率的に推定する、高解像度の差異を検出のためのプロトコルについて述べるドナー菌活用を開始します。
Abstract
細菌の活用は、クェン DNA 要素を介して抗生物質耐性遺伝子の水平伝播の重要なステップです。異なる条件下での活用頻度の詳細な比較はどのように接合要素が広がる自然の中を理解する必要があります。ただし、活用頻度を比較するための従来の方法は、高いバック グラウンドの選択板追加活用イベントが発生したため詳細な比較に適していません。我々 は正常に最確数 (MPN) 法とさらに選択的液体媒体の活用を防ぐために抗生物質の高濃度導入することによってバック グラウンドを減少しました。また、我々 は蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えによって受信者プールへの単一ドナー細胞の並べ替えによってしばしば方法の確率を推定するためのプロトコルにドナー細胞の開始の活用を開発しました。2 種のプラスミドを使用すると、攪拌率が異なる液体培地で pBP136 と pCAR1、シュードモナスの putida細胞における共役周波数の違いを検出可能性があります。PCAR1 のより pBP136 の活用開始の頻度が高かった。これらの結果を使用して、これらの 2 種のプラスミドの活用機能をよりよく理解できます。
Introduction
モバイル遺伝的要素、接合性プラスミドと統合・ クェン要素 (Ice) の細菌の活用は、遺伝情報の横方向の広がりに重要です。急速な細菌の進化と適応を促進するため、多剤耐性遺伝子1,2を送信できます。活用頻度は暴徒と MPF タイプ3,4に従って分類される、性線毛を含む DNA (MOB) と嵌合ペア形成 (MPF) の動員のクェン要素に関する蛋白質によって影響を受けます 5。ドナーとレシピエントのペア6セル7,8,9,10、11,12 (の成長条件によって影響されるも成長率、細胞密度、固体表面や液体培地、温度、養分可用性、および陽イオンの存在)。方法接合要素に広がって細菌を理解するには、詳細に共役周波数を比較する必要は。
通り、ドナーと受信者ペア交尾後の活用頻度は従来の方法では推定通常。(i) まず、ドナーとレシピエントのコロニー数がカウントされます。(ii)、(しかしながら =) 接合要素を受信した受信者のコロニーがカウントされます。(iii)、最後に、活用頻度はドナーや受領者13人でコロニー形成単位 (CFU) しかしながらを割ることによって計算されます。ただし、このメソッドを使用すると、背景が細胞密度が高い10のとき、しかしながらを取得するために使用する選択式ナンバー プレートにも発生することができます追加活用イベントのため高い。したがって、(10 倍差) の下の頻度のわずかな違いを検出することは困難です。我々 は最近、抗生物質の高濃度を含む液体培地を用いた最確数 (MPN) 法を導入しました。このメソッドは、さらに選択的な媒体の活用を阻害することによってバック グラウンドを減少したがって、高解像度の活用頻度を推定する可能性があります。
共役は、3 つのステップに分けることができます: (1) ドナーと受信者の添付ファイルのペア、伝達の開始 (2) と (3) のペア14の解離。手順 (1) と (3) の間には、ドナーと受信者セル間の物理的な相互作用です。したがって、細胞密度と環境条件が性線毛の機能も重要な手順に影響することができます。ステップ (2) は、プラスミド、ドナーと受信者のさまざまな機能によって影響を受ける可能性があります、外部の変化に対応した抱合に関与する複数の遺伝子の発現によって調整される可能性が高い。粒子として電池の予測を使用して物理的な添付ファイルやドナーと受信者のペアの剥離を数学的にシミュレートできます、ただし、ステップ (2) の周波数を実験的測定ください。いくつか報告方法の直接観測にしばしばドナーを活用 [ステップ (2)] 蛍光顕微鏡15,16; を使用して開始されています。ただし、これらのメソッドは多数のセルを監視する必要があるために、高スループットではありません。したがって、蛍光性によって作動セル (FACS) を並べ替えを使用して、ステップ (2) の発生の確率を推定する手法を開発しました。本手法は、活用に必須の遺伝子の同一証明なしのすべてのプラスミッドに適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、プロトコルを提案高解像度のさまざまな状況で活用頻度の差異を検出 MPN メソッドを使ってしかしながらの数を推定します。プロトコルの 1 つの重要なステップは、しかしながらが育たないまで交尾後ドナーとレシピエントの混合物を希釈です。高濃度の抗生物質の活用をさらに防ぐために選択の液体培地に別のステップを追加すること。これらのプロシージャは、選択培地での?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士 k. 蒲池の国立感染症研究所 (日本) にありがとう pCAR1 を提供するため pBP136 と東京大学 (日本) の野尻浩之教授を提供します。デンマークの技術的な大学の教授 Molin Sølen へ pJBA28 を提供することに感謝しております。この作品は、日本学術振興会科研費によって支えられた (許可番号 15 H 05618 と 15KK0278) ms (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/、https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/)。
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
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