Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen
Summary
Mit dem Ziel, die Verhaltensweisen der verschiedenen bakteriellen konjugative DNA-Elemente unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen, beschreiben wir ein Protokoll für die Unterschiede in der Konjugation Frequenz mit hoher Auflösung, einzuschätzen, wie effizient das Spender-Bakterium Konjugation initiiert.
Abstract
Bakterielle Konjugation ist ein wichtiger Schritt in die horizontale Übertragung von Antibiotikaresistenz-Genen über ein konjugative DNA-Element. Eingehende Vergleiche der Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen müssen verstehen, wie das konjugative Element in der Natur verbreitet. Jedoch eignen sich herkömmliche Methoden zum Vergleichen von Konjugation Frequenz nicht für eingehende Vergleiche wegen der hohen Hintergrund durch das Auftreten von zusätzlichen Konjugation Ereignissen auf der selektiven Platte verursacht. Durch Einführung einer wahrscheinlichste Anzahl (MPN) Methode und eine höhere Konzentration von Antibiotika zur Verhinderung weiterer Konjugation in selektiven flüssigen Medium haben wir erfolgreich den Hintergrund reduziert. Darüber hinaus entwickelten wir ein Protokoll für die Schätzung der Wahrscheinlichkeit wie oft Spender Zellen initiieren Konjugation durch einzelne Spenderzellen in Empfänger-Pools durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) sortieren. Im flüssigen Medium unterschiedlich rühren konnte mit zwei Plasmide, pBP136 und pCAR1, die Unterschiede in der Konjugation Frequenz in Pseudomonas Putida Zellen nachgewiesen werden. Die Frequenzen der Konjugation Einweihung waren höher für pBP136 als für pCAR1. Mit diesen Ergebnissen können wir besser verstehen, die Konjugation Features in diese zwei Plasmide.
Introduction
Bakterielle Konjugation von mobile genetische Elemente, konjugative Plasmide und integrative und konjugative Elemente (ICEs) ist wichtig für die horizontale Verbreitung der genetischen Information. Es kann fördern schnelle bakterielle Entwicklung und Anpassung und multidrug-Resistenz-Gene-1,–2zu übertragen. Die Konjugation Frequenz kann beeinflusst werden, durch Proteine codiert auf die konjugative Elemente für die Mobilisierung der DNA (MOB) und Paarung Paarbildung (MPF), einschließlich Geschlecht Pili, die laut MOB und MPF Typ3,4eingestuft sind, 5. Es kann auch durch die Spender und Empfänger Paar6 und die Wachstumsbedingungen der Zellen7,8,9,10,11,12 (beeinflusst werden Wachstumsrate, Zelldichte, feste Oberfläche oder flüssigen Medium, Temperatur, Nährstoffverfügbarkeit und die Anwesenheit von kationen). Um zu verstehen wie die konjugative Elemente unter Bakterien verbreiten, ist es notwendig, Konjugation Frequenz im Detail zu vergleichen.
Die Konjugation Frequenz zwischen Spender und Empfänger-Paare nach der Paarung werden in der Regel mit konventionellen Methoden wie folgt geschätzt. (i) zuerst werden die Zahlen von Spender und Empfänger Kolonien gezählt. (Ii) dann werden die Empfänger Kolonien, die die konjugative Elemente erhalten (= Transconjugants) gezählt; (Iii) und schließlich die Konjugation Frequenz errechnet sich durch Division der Koloniebildenden Einheiten (KBE) von der Transconjugants von denen der Spender oder Empfänger13. Wenn Sie diese Methode verwenden, ist der Hintergrund jedoch durch zusätzliche Konjugation Ereignisse, die auch, auf die selektive Platten verwendet auftreten können, um Transconjugants zu erhalten, wenn die Zelldichte hoch10ist hoch. Daher ist es schwer zu erkennen, kleine Unterschiede in der Häufigkeit (unter 10-divisibel Unterschied). Wir hat vor kurzem eine wahrscheinlichste Anzahl (MPN) Methode mit flüssigen Medium mit einer höheren Konzentration von Antibiotika. Diese Methode reduziert den Hintergrund durch die Hemmung weitere Konjugation in selektiven Medium; So konnte die Konjugation Frequenz mit höherer Auflösung geschätzt werden.
Konjugation kann in drei Schritte unterteilt werden: (1) Befestigung der Spender-Empfänger koppeln (2) die Einleitung der konjugative Übertragung und (3) Dissoziation der paar14. Während der Schritte (1) und (3) gibt es physikalische Interaktion zwischen Spender und Empfänger Zellen; So können Zelldichte und die Umweltbedingungen diese Schritte beeinflussen, obwohl die Merkmale des Sex-Pili auch wichtig sind. Schritt (2) ist wahrscheinlich durch den Ausdruck von mehreren Genen in Konjugation als Reaktion auf äußere Veränderungen, geregelt, die durch verschiedene Merkmale von Plasmid, Spender und Empfänger betroffen sein könnten. Obwohl die physische Anlage oder Ablösung der Spender-Empfänger-Paare mathematisch kann eine Schätzung der Zellen als Partikel verwenden simuliert werden, sollte die Häufigkeit der Schritt (2) experimentell gemessen werden. Es gab ein paar Berichte über direkte Beobachtungen wie oft Geber initiieren können Konjugation [Schritt (2)] mit Fluoreszenz-Mikroskopie15,16; Diese Methoden sind jedoch nicht Hochdurchsatz-da eine große Anzahl von Zellen überwacht werden muss. Daher entwickelten wir eine neue Methode zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Schritt (2) mittels Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS). Unsere Methode kann auf alle Plasmid, ohne Identifizierung der wesentlichen Gene für Konjugation angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine hochauflösende Protokoll zum Erkennen von Unterschieden in der Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen, mit einer MPN-Methode zur Schätzung der Anzahl der Transconjugants. Ein wichtiger Schritt in dem Protokoll ist die Mischung von Spender und Empfänger nach der Paarung bis keine Transconjugants wachsen verdünnen. Ein weiterer Schritt ist die selektive flüssigen Medium zur Verhinderung weiterer Konjugation hohe Konzentrationen von Antibiotika hinzufügen. Diese Verfahre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. K. Kamachi des National Institute of Infectious Diseases (Japan) für die Bereitstellung von pBP136 und Prof. Dr. H. Nojiri an der University of Tokyo (Japan) für die Bereitstellung von pCAR1. Wir sind auch dankbar, Professor Dr. Molin Sølen der Technical University of Denmark für die Bereitstellung von pJBA28. Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (Grant-Nummern 15H 05618 und 15KK0278), MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
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