Определенных Xeno бесплатно и фидер свободной культуры условия для моделей клеток поколения прав человека iPSC производные сетчатки
Summary
Производство специализированных клеток сетчатки от плюрипотентных стволовых клеток является поворотным моментом в развитии на основе стволовых клеток лечение заболеваний сетчатки. В настоящем документе описывается простой метод для эффективного поколения сетчатки organoids и пигментированной эпителия сетчатки для основных, поступательные и клинических исследований.
Abstract
Производство специализированных клеток от плюрипотентных стволовых клеток предоставляет мощный инструмент для разработки новых подходов для регенеративной медицины. Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) является особенно привлекательным для нейродегенеративные болезни исследований, в том числе дистрофий сетчатки, где iPSC производные сетчатки клетки модели Марк крупный шаг вперед для понимания и бороться слепоты. В этой статье мы опишем простой и масштабируемый протокол для создания, Зрелые и криоконсервировать сетчатки organoids. На основании среднего изменения, основным преимуществом этого метода является избежание несколько и времени шаги обычно требуются в управляемое дифференциации iPSCs. Подражая на ранних этапах развития сетчатки последовательных изменений определенных СМИ на адэрентных человека iPSC культур, этот протокол позволяет одновременное поколения самостоятельного формирования структур neuroretinal и сетчатки пигментные клетки эпителия (ПЭС) в воспроизводимость и эффективным образом в 4 недели. Эти структуры, содержащие сетчатки прогениторных клеток (RPC) может быть легко изолированы для дальнейшего созревания в состоянии плавающей культуры, обеспечивая дифференцирование RPC в семи типы клеток сетчатки, присутствующих в взрослого человека сетчатки. Кроме того мы описываем, быстрые методы криоконсервирования сетчатки organoids и ПЭС клетки для длительного хранения. Сложенные вместе, методы, описанные здесь будет полезным для производства и банк человека iPSC производные сетчатки клетки или ткани для фундаментальных и клинических исследований.
Introduction
Сетчатка является неотъемлемой частью центральной нервной системы (ЦНС) и имеет ограниченные возможности для самопроизвольно восстанавливаться после травмы или заболеваний. Таким образом дегенеративных патологий, вызывая потери окончательного клеток сетчатки, например возрастной макулярной дегенерации (AMD) и пигментный ретинит (RP), глаукома, диабетическая ретинопатия, обычно приводит к необратимой слепоте. Спасая выродились сетчатки является одной из основных задач, для которых на основе стволовых клеток лечение, направленный для замены поврежденного или утраченного клетки являются одним из наиболее перспективных подходов1,2,3. Плюрипотентных стволовых клеток как клетки человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеют способность расширяться бесконечно в культуре, и они имеют потенциал для производства любых типов клеток. Достижения в наше понимание сетчатки развития и совершенствования в vitro протоколы для человека iPSC дифференциация привели к поколения сетчатки organoids7,8,9, 10,,1112. Все крупные сетчатки клеток, включая клетки сетчатки ганглии (РГК) и фоторецепторов сетчатки пигментные клетки эпителия (ПЭС) были успешно дифференцированы от человеческих ЭСК и iPSCs4,5, 6. основанный на SFEB (сыворотка свободной культуры embryoid тела, как агрегатов) метод, разработанный Eiraku и др. 13, самостоятельное формирование сетчатки organoids могут быть получены ESC или iPSC, полученных embryoid тела, как агрегатов в определенных внеклеточный матрикс компонентов7,10,14. Но эти протоколы являются сложные, требующие большое количество шагов, не всегда совместимы с большим производства клеток для терапевтических подходов или наркотиков скрининг. Таким образом выбор метода для получения человеческих клеток сетчатки имеет решающее значение и метод должен быть надежным, масштабируемым и эффективным.
Здесь основываясь на нашей предыдущей публикации15, опишем каждый шаг для простой и эффективной поколения клетки сетчатки через сетчатки органоид самостоятельного формирования от адэрентных человеческого iPSCs, культивируемый в фидер свободных и без Зенона состояние. Начиная от рутинных культур адэрентных человеческого iPSCs, этот протокол требует лишь простой последовательных среднего разрешена поколения клетки iPS производные ПЭС (hiRPE) и neuroretinal структур в течение 4 недель. После ручной изоляции hiRPE может быть расширена и сетчатки структуры можно культивировали как плавающие organoids где клетки сетчатки прародитель способны дифференцироваться в все типы клеток сетчатки в последовательном порядке в соответствии с человека в естественных условиях retinogenesis. Наконец для исследований или клинический перевод, мы описываем криоконсервирования метод, позволяющий длительного хранения всей сетчатки organoids и hiRPE клеток не затрагивая их фенотипические характеристики и функциональность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает, как производить НПП клетки и сетчатки organoids, содержащий сетчатки РГК и фоторецепторов, от человеческих плюрипотентных стволовых клеток в условиях xeno свободных и без подачи. Совместим с процесс надлежащей производственной практики (GMP), метод выращивают здесь пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов группы Goureau за их вклад во время настройки методов, описанных здесь и G. Гальярди и м. Garita за их критического чтения. Эта работа была поддержана от грантов от НРУ (GPiPS: АНР-2010-RFCS005; SightREPAIR: АНР-16-CE17-008-02), Ассоциация Франции сетчатки и передачи технологии компании SATT Lutech. Она также была проведена в рамках LABEX LIFESENSES (АНР-10-LABX-65) поддерживается НРУ в рамках программы будущее Investissements (АНР-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
