Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC
Summary
La production de cellules spécialisées de la rétine de cellules souches pluripotentes est un tournant dans le développement de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies de la rétine. Le présent document décrit une méthode simple pour une génération efficace d’organoïdes rétinienne et l’épithélium pigmentaire rétinien pour la recherche fondamentale, translationnelle et clinique.
Abstract
La production de cellules spécialisées de cellules souches pluripotentes fournit un outil puissant pour développer de nouvelles approches pour la médecine régénérative. L’utilisation des cellules souches pluripotentes humaines (CISP) est particulièrement intéressante pour des études de maladies neurodégénératives, y compris les dystrophies rétiniennes, où les modèles de cellules rétiniennes dérivées iPSC marquent une avancée majeure pour comprendre et lutter contre la cécité. Dans cet article, nous décrivons un protocole simple et évolutif pour générer, mature et cryoconservé organoïdes rétinienne. Basé sur l’évolution des moyennes, le principal avantage de cette méthode est d’éviter de multiples et fastidieuses étapes généralement exigés dans une différenciation guidée du CISP. Imitant les phases précoces de développement rétinienne par modifications successives des milieux définis sur des cultures de l’iPSC humaine adhérentes, ce protocole permet la production simultanée de former des structures neuroretinal et rétine pigmentées cellules épithéliales (RPE) dans un manière efficace et reproductible en 4 semaines. Ces structures contenant des cellules souches rétiniennes (RPC) peuvent être facilement isolés pour davantage de maturation dans un état de culture flottante permettant la différenciation des appels de procédure distante dans les sept types de cellules rétiniennes présents dans la rétine humaine adulte. En outre, les auteurs décrivent des méthodes rapides pour la cryoconservation d’organoïdes rétinienne et cellules RPE pour le stockage à long terme. Combinés ensemble, les méthodes décrites ici seront utiles pour produire et bancaires dérivés iPSC rétiniens cellules ou tissus humains pour la recherche fondamentale et clinique.
Introduction
La rétine fait partie intégrante du système nerveux central (CNS) et a une capacité limitée à se régénérer spontanément suite à un traumatisme ou de maladies. Par conséquent, les pathologies dégénératives entraînant la perte de cellules rétiniennes définitives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinite pigmentaire (RP), glaucome et la rétinopathie diabétique, typiquement entraîner une cécité irréversible. Sauver la rétine dégénérée est un enjeu majeur pour lequel des thérapies à base de cellules souches visant à remplacer les cellules endommagées ou perdues sont l’une des plus prometteuses approches1,2,3. Cellules souches pluripotentes comme les cellules souches embryonnaires (CSE) cellules ou les cellules souches pluripotentes humaines (CISP) ont la capacité d’étendre indéfiniment en culture, et ils ont le potentiel de produire tous les types de cellules. Progrès dans notre compréhension du développement rétinienne et l’amélioration de in vitro protocoles pour iPSC humaine différenciation ont donné lieu à la génération de rétine organoïdes7,8,9, 10,11,12. Toutes les cellules rétiniennes majeurs, y compris les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et photorécepteurs rétiniens cellules épithéliales pigmentées (RPE), ont été correctement différenciés des humains ESCs et CISP4,5, 6. basé sur la méthode SFEB (culture sans sérum des agrégats de type corps embryoïdes) développée par Eiraku et al. 13, autoformation d’organoïdes rétiniennes peut être obtenue de dérivés ESC ou iPSC embryoïdes corps-comme agrégats dans la matrice extracellulaire définis composants7,10,14. Mais ces protocoles sont complexes, nécessitant un grand nombre d’étapes n’est pas toujours compatibles avec la grande production de cellules pour les approches thérapeutiques ou de dépistage des drogues. Ainsi, le choix de la méthode pour produire des cellules de la rétine humaines est critique et la méthode doit être robuste, évolutive et efficace.
Basé sur notre précédente publication15, nous décrivons ici chaque étape pour une génération simple et efficace des cellules rétiniennes par autoformation organoïde rétinienne d’adhérents CISP humaine cultivée dans une condition de xeno-sans et sans chargeur. À partir de cultures systématiques des adhérents CISP humaine, ce protocole requiert uniquement un milieu simple successive changer pour permettre la génération de cellules iPS RPE (hiRPE) et des structures neuroretinal en 4 semaines. Après un isolement manuel, hiRPE peut être développé et les structures rétiniennes peuvent être cultivées comme flottant organoïdes où les cellules souches rétiniennes sont capables de se différencier en tous types de cellules rétiniennes dans un ordre séquentiel compatible avec l’homme en vivo retinogenesis. Enfin, pour la promotion de la recherche ou la traduction clinique, nous décrivons une méthode de cryoconservation permettant le stockage à long terme d’ensemble rétinienne organoïdes et hiRPE cellules sans affecter leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnalités.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit comment produire des cellules RPE et organoïdes rétinienne, contenant les CGR rétiniennes et photorécepteurs, de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de xeno-gratuit et sans chargeur. Compatible avec le processus de bonnes pratiques de fabrication (BPF), la méthode cultivé présenté ici permet une grande production de cellules rétiniennes dérivées iPSC comme cellules RPE, CGR et photorécepteurs pour le développement de thérapies à base de cellules souches et de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres de l’équipe de Goureau pour leur contribution au cours de la mise en place des méthodes décrites ici et G. Gagliardi et M. Garita pour leur lecture critique. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’ANR (GPiPS : ANR-2010-RFCS005 ; SightREPAIR : ANR-16-CE17-008-02), l’Association de Retina France et la transfert de technologie société SATT Lutech. Il a également été effectuée dans le cadre de la LIFESENSES LABEX (ANR-10-LABX-65), soutenu par l’ANR dans le programme d’Investissements d’avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
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