Summary

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

Published: September 06, 2018
doi:

Summary

La produzione di cellule specializzate della retina da cellule staminali pluripotenti è un punto di svolta nello sviluppo della terapia a base di cellule staminali per malattie retiniche. Il presente documento descrive un metodo semplice per una generazione efficiente dei organoids della retina e dell’epitelio pigmentato retinico per la ricerca di base, traslazionale e clinica.

Abstract

La produzione di cellule specializzate da cellule staminali pluripotenti fornisce un potente strumento per sviluppare nuovi approcci per la medicina rigenerativa. L’uso di cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSCs) è particolarmente interessante per gli studi di malattie neurodegenerative, tra cui distrofie retiniche, dove modelli iPSC-derivato delle cellule retiniche segnano un importante passo avanti per capire e combattere la cecità. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice e scalabile per generare, maturo e crioconservare organoids retinica. Basate sul cambiamento medio, il vantaggio principale di questo metodo è quello di evitare più e passaggi che richiede tempo comunemente richiesti in una differenziazione guidata delle iPSCs. Imitando le prime fasi di sviluppo retinico da successive modifiche dei media definiti sulle culture aderente iPSC umana, questo protocollo permette la generazione simultanea di self-formando strutture di neuroretinal e le cellule epiteliali pigmentate della retina (RPE) in un in modo riproducibile ed efficiente in 4 settimane. Queste strutture contenenti cellule progenitrici retinica (RPC) possono essere facilmente isolate di ulteriore maturazione in una condizione di cultura galleggiante che permette la differenziazione di RPC in sette tipi retinica delle cellule presenti nella retina umana adulta. Inoltre, vengono descritti metodi rapidi per la crioconservazione dei organoids retinica e cellule RPE per immagazzinaggio a lungo termine. Combinati insieme, i metodi descritti qui sarà utili per produrre e Banca iPSC-derivato della retina cellule o tessuti umani per la ricerca clinica e di base.

Introduction

La retina è parte integrante del sistema nervoso centrale (SNC) e ha una capacità limitata di rigenerarsi spontaneamente a seguito di una lesione traumatica o malattie. Di conseguenza, patologie degenerative, causando la perdita definitiva delle cellule della retina, come la degenerazione maculare senile (AMD), retinite pigmentosa (RP), il glaucoma e la retinopatia diabetica, in genere portano a cecità irreversibile. Salvataggio della retina degenerata è una sfida importante per i quali terapie basate sulle cellule staminali che mira a sostituire le cellule danneggiate o perse sono uno dei più promettenti approcci1,2,3. Cellule staminali pluripotenti come cellule staminali embrionali umane (CES) o cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSCs) hanno la capacità di essere espansa all’infinito nella cultura, e hanno il potenziale per produrre qualsiasi tipo di cellula. Progressi nella nostra comprensione dello sviluppo della retina e il miglioramento in vitro di protocolli per differenziazione umana iPSC hanno provocato la generazione di organoids retinica7,8,9, 10,11,12. Tutte le principali cellule della retina, incluse le cellule retiniche del ganglio (RGCs) fotorecettori e cellule epiteliali pigmentate retiniche di (RPE), sono state correttamente differenziate dai umano CES e iPSCs4,5, 6. sulla base del metodo SFEB (coltura privo di siero di embryoid corpo-come aggregati) sviluppato da Eiraku et al. 13, autoformazione dei organoids retinica sono ottenibili da ESC – o iPSC-derivati embryoid corpo-come aggregati nella matrice extracellulare definiti componenti7,10,14. Ma questi protocolli sono complessi, che richiedono un numero elevato di passaggi non sempre compatibili con la grande produzione di cellule per approcci terapeutici o lo screening di stupefacenti. Così, la scelta del metodo per la produzione di cellule della retina umane è fondamentale e il metodo deve essere robusta, scalabile ed efficiente.

Qui, sulla nostra precedente pubblicazione15, descriviamo ogni passo per una generazione semplice ed efficiente di cellule retiniche attraverso autoformazione organoid retinico da aderente iPSCs umane coltivate in una condizione di alimentatore e xeno-free. A partire da colture sistematiche di aderente iPSCs umane, questo protocollo richiede solo un semplice mezzo successivo cambiando per consentire la generazione di cellule iPS-derivate di RPE (hiRPE) e di neuroretinal strutture in 4 settimane. Dopo un isolamento manuale, hiRPE può essere espansa e strutture retiniche possono essere coltivate come galleggiante organoids dove le cellule progenitrici della retina sono in grado di differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche in un ordine sequenziale coerenza con l’essere umano in vivo retinogenesis. Infine, per avanzamento di ricerca o traduzione clinica, descriviamo un metodo di crioconservazione consentendo l’archiviazione a lungo termine dei organoids intero retinica e hiRPE delle cellule senza influire sulle loro caratteristiche fenotipiche e funzionalità.

Protocol

Il protocollo descritto in questo documento segue le linee guida del comitato etico dell’Institut de la Vision ricerca. L’Institut de la Vision è stato permesso la manipolazione del campione umano secondo la norma francese. Trattamento del campione segue la protezione dei dati del paziente in conformità con i principi di Helsinki e ai regolamenti nazionali dopo l’approvazione etica del “Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile-de-V”. 1. preparazione di terreni di coltura e piatti …

Representative Results

Il primo passo per la differenziazione di iPSC umano coltivato in condizioni privo di alimentatore16 è di chiudere la pagina di auto-rinnovamento macchinari usando Bi mezzo per incoraggiare una differenziazione spontanea (Figura 1A). Quindi, a D2, il mezzo di Bi è completato con un supplemento di N2 per guidare la differenziazione iPSCs cellule verso i lignaggi neurale e retiniche. Questo processo porta alla comparsa dei germogli di …

Discussion

Questo protocollo descrive come produrre cellule RPE e organoids retinica, contenente RGCs retinico e fotorecettori, da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di xeno e alimentatore-free. Compatibile con il processo di buona fabbricazione (GMP), il metodo coltivato qui presentato permette un’ampia produzione di cellule retiniche iPSC-derivati come cellule RPE, RGCs e fotorecettori per lo sviluppo di terapie basate sulle cellule staminali e droga individuazione di approcci per il trattamento futuro di malattie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare i membri del team di Goureau per il loro contributo durante la messa a punto dei metodi descritti qui e G. Gagliardi e M. Garita per loro lettura critica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR (GPiPS: RFCS005-2010-ANR; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), la Retina France Association e la tecnologia di trasferimento azienda Lutech SATT. Inoltre è stata effettuata nell’ambito della LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) supportato da ANR all’interno del programma di Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).

Materials

Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

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Cite This Article
Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

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