קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא
Summary
הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.
Abstract
הייצור של תאים מיוחדים מתאי גזע pluripotent מספק כלי רב עוצמה כדי לפתח גישות חדשות עבור רפואה רגנרטיבית. השימוש בתאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם (iPSCs) הוא אטרקטיבי במיוחד ללימודים מחלות ניווניות, כולל dystrophies ברשתית, נגזר iPSC התא רשתית מודלים כדי לסמן היכן צעד חשוב להבין ולהילחם עיוורון. בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומדרגי צור, בוגר של cryopreserve organoids ברשתית. מבוסס על שינוי בינוני, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא להימנע מרובים ודרשה זמן רב שלבים בדרך כלל בהבחנה מודרכים של iPSCs. מחקה את השלבים הראשונים של התפתחות הרשתית על ידי שינויים רצופים של מדיה מוגדרים על תרבויות iPSC האדם חסיד, פרוטוקול זה מאפשר הדור בו זמנית של עצמי ויוצרים מבנים neuroretinal, פיגמנט אפיתל (RPE) תאים ברשתית ב באופן יעיל הדירים ב- 4 שבועות. מבנים אלה המכילים ובתאים ברשתית (Rpc) ניתן לבודד בקלות על התבגרות נוספת במצב תרבות צף המאפשר את הבידול של Rpc לתוך סוגי תאים ברשתית שבע נוכח הרשתית האנושית למבוגרים. בנוסף, אנו מתארים שיטות מהירה הקפאה קריוגנית של הרשתית organoids ואת תאי RPE לאחסון לטווח ארוך. יחד בשיטות המתוארות כאן יהיה שימושי כדי לייצר, בנק תאים ברשתית, נגזר iPSC אדם או רקמות לצורך מחקר בסיסי וקליני.
Introduction
הרשתית היא חלק אינטגרלי של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לבין בעל קיבולת מוגבלת להתחדש באופן ספונטני לאחר פציעה טראומטית או מחלות. לכן, פתולוגיות ניוונית גרימת איבוד תאים ברשתית סופית, כגון הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD), רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, בדרך כלל להוביל לעיוורון בלתי הפיך. הצלת הרשתית מנוונת היא אתגר גדול עבורה טיפולים מבוססי תאי גזע במטרה להחליף את התאים ניזוק או אבד הם אחד של המבטיחים ביותר גישות1,2,3. גזע pluripotent כתאי תאי גזע עובריים (ESCs) או בתאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם (iPSCs) יש את היכולת להיות מורחב ללא הגבלת זמן, תרבות, ויש להם את היכולת לייצר כל סוגי תאים. ההתקדמות ההבנה שלנו של התפתחות הרשתית ושיפור במבחנה פרוטוקולים עבור בידול iPSC אנושי גרמו הדור של הרשתית organoids7,8,9, 10,11,12. כל התאים ברשתית העיקריים, כולל תאי גנגליון (RGCs), photoreceptors של פיגמנט אפיתל (RPE) תאים ברשתית, יש כבר בהצלחה תריז האנושי ESCs ו- iPSCs4,5, 6. מבוסס על שיטת SFEB (ללא סרום תרבות של אגרגטים גוף דמוי embryoid) שפותחה על ידי. של איראקא et al. 13, היווצרות עצמית של הרשתית organoids ניתן להשיג ESC או iPSC-נגזר אגרגטים גוף דמוי embryoid מטריצה חוץ-תאית מוגדר רכיבים7,10,14. אבל פרוטוקולים אלה מורכבות, הדורשות מספר רב של צעדים אינו תמיד תואם עם ייצור גדול של תאים עבור גישות טיפוליות או והתרופות הקרנה. לכן, הבחירה של השיטה כדי לייצר תאים ברשתית האנושי הוא קריטי, השיטה צריכה להיות חזקה, מדרגי ויעיל.
כאן, בהתבסס על הפרסום הקודם שלנו15, נתאר כל שלב לדור פשוטה ויעילה של תאים ברשתית דרך תא צורב ברשתית היווצרות עצמית של חסיד iPSCs האנושי מעובדות במצב מזין ו קסנו-חופשית. החל מתרבויות שגרתית של חסיד iPSCs האנושי, פרוטוקול זה דורש רק מדיום רצופים פשוט שינוי כדי לאפשר את הדור של תאי RPE (hiRPE) שב ס-derived ומבני neuroretinal ב 4 שבועות. לאחר בידוד ידני, hiRPE ניתן להרחיב ותרבותית המבנים ברשתית יכולה להיות צפים organoids איפה הרשתית ובתאים הם מסוגלים להבדיל לתוך כל סוגי תאים ברשתית סדר רציפים בקנה אחד עם האדם אין ויוו retinogenesis. לבסוף, לקידום המחקר או תרגום קליני, נתאר שיטת הקפאה קריוגנית המאפשר אחסון לטווח ארוך של organoids כל רשתית ותאים hiRPE מבלי להשפיע על מאפייני פנוטיפי והפונקציונליות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאי RPE, organoids ברשתית, המכילה RGCs ברשתית, photoreceptors, מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים קסנו-חופשית, נטולת מזין. תואם עם תהליך אימון ייצור טוב (GMP), השיטה מעובדות המובאת כאן מאפשר הפקה גדולה של נגזר iPSC תאים ברשתית תאי RPE, RGCs ו photoreceptors לפיתוח טיפולים מבוססי תאי גזע, סמים גילוי ג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות חברי הצוות של Goureau לקבל את התשומה שלהם במהלך הסידור של השיטות המתוארות כאן, ו Gagliardi ג ו מ Garita לקריאה ביקורתית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), האגודה צרפת הרשתית ואת הטכנולוגיה העברת החברה הם העלו יחד Lutech. זה בוצע גם במסגרת LIFESENSES LABEX (ANR-10-LABX-65) נתמכת על-ידי ANR בתוך התוכנית d’Avenir Investissements (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
