Alimentador-libre las condiciones de cultivo para la generación de humanos derivados de iPSC de modelos de celulares de retina y definido sin Xeno
Summary
La producción de células especializadas de la retina de células madre pluripotentes es un punto de inflexión en el desarrollo de la terapia basada en células madre para enfermedades de la retina. El presente trabajo describe un método sencillo para una generación eficiente de organoides de retina y epitelio pigmentado retiniano para investigación básica, traslacional y clínica.
Abstract
La producción de células especializadas de las células de vástago pluripotent proporciona una poderosa herramienta para desarrollar nuevos enfoques para la medicina regenerativa. El uso de las células de vástago pluripotent humanas (iPSCs) es particularmente atractivo para estudios de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo distrofias retinianas, donde modelos de células retinianas iPSC marcan un importante paso adelante para entender y combatir la ceguera. En este papel, describimos un protocolo simple y escalable para generar, madurar y criopreservar organitas retiniana. Basado en el cambio de medio, la principal ventaja de este método es evitar múltiples y lentos pasos comúnmente necesitan una diferenciación guiada de iPSCs. Imitando las primeras fases de desarrollo retiniano por sucesivos cambios de medios definidos en iPSC humanas adherente culturas, este protocolo permite la generación simultánea de uno mismo-formar del neuroretinal estructuras y retiniano epitelial (RPE) las células pigmentadas en una manera eficiente y reproducible en 4 semanas. Estas estructuras que contienen células progenitoras de retina (RPC) pueden ser fácilmente aisladas de mayor maduración en una condición de cultura flotante que permite la diferenciación de RPC en los siete tipos de células retinianas presentes en la retina humana adulta. Asimismo, describen métodos rápidos para la criopreservación de los organoides retiniano y las células RPE para almacenamiento a largo plazo. Combinados, los métodos descritos aquí será útiles para producir y Banco humanas derivado de iPSC retinianas células o tejidos para investigación básica y clínica.
Introduction
La retina es una parte integral del sistema nervioso central (SNC) y tiene una capacidad limitada para regenerar espontáneamente después de una lesión traumática o de enfermedades. Por lo tanto, patologías degenerativas que causan pérdida definitiva de la célula retiniana, como degeneración macular senil (DMS), retinitis pigmentosa (RP), glaucoma y retinopatía diabética, suele llevan a la ceguera irreversible. Rescatar la retina degenerada es un gran desafío para que las terapias basadas en células madre con el objetivo de reemplazar las células dañadas o perdidas son uno de los más prometedores enfoques1,2,3. Células pluripotentes como las células células de vástago embrionarias humanas (ESCs) o las células de vástago pluripotent humanas (iPSCs) tienen la capacidad de ampliarse indefinidamente en la cultura, y tienen el potencial para producir cualquier tipo de célula. Avances en nuestra comprensión del desarrollo retiniano y la mejora de in vitro los protocolos de diferenciación de iPSC humanas han dado como resultado la generación de retina organitas7,8,9, 10,11,12. Todas las células retinianas principales, incluyendo las células ganglionares de la retina (RGCs), fotorreceptores y retiniano epitelial (RPE) las células pigmentadas, han diferenciado con éxito humano CES y iPSCs4,5, 6. basado en el método SFEB (cultivo libre de suero de embryoid cuerpo-como los agregados) desarrollado por Eiraku et al. 13, formación autodidacta de organoides retiniana puede obtenerse derivado de ESC o iPSC embryoid cuerpo-como los agregados definidos matriz extracelular componentes7,10,14. Pero estos protocolos son intrincados, requiriendo una gran cantidad de pasos no es siempre compatibles con la gran producción de células para enfoques terapéuticos o detección de drogas. Así, la elección del método para producir células de la retina humanas es fundamental y el método debe ser robusto, escalable y eficiente.
Aquí, en base a nuestra anterior publicación15, describir cada paso para una simple y eficiente generación de células de la retina a través de la formación autodidacta de retina organoide de adherente iPSCs humana cultivada en una condición libre de alimentador y xeno. A partir de rutina culturas de iPSCs humano adherentes, este protocolo requiere solamente un simple medio sucesivo cambiando para permitir la generación de las células RPE (hiRPE) derivadas de iPS y estructuras del neuroretinal en 4 semanas. Después de un aislamiento manual, hiRPE pueden ampliarse y las estructuras retinianas pueden cultivarse como flotando organoides donde las células progenitoras de retina son capaces de diferenciarse en todos los tipos de células retinianas en un orden secuencial y coherente con el ser humano en vivo retinogénesis. Finalmente, para el avance de la investigación o traducción clínica, se describe un método de criopreservación que permite el almacenamiento a largo plazo de toda retina organoides y hiRPE células sin afectar su funcionalidad y características fenotípicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe cómo producir células RPE y organitas retiniana, que contiene RGCs retinales y los fotorreceptores, de células de vástago pluripotent humanas en condiciones libre de xeno y alimentador. Compatible con el proceso de buenas prácticas de manufactura (GMP), el método cultivado presentada aquí permite una gran producción de células de la retina derivadas de iPSC como células RPE, RGCs y fotorreceptores para el desarrollo de terapias basadas en células madre y de la droga descubrimiento de m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del equipo de Goureau su entrada durante la instalación de los métodos descritos aquí y G. Gagliardi y M. Garita por su lectura crítica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), la Asociación de Francia de la Retina y la transferencia de tecnología empresa SATT Lutech. También se realizó en el marco de la LIFESENSES LABEX (ANR-10-LABX-65) apoyado por la ANR en el programa de Avenir Investissements (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
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