Summary

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

يمكن أن تستخدم كنماذج الكبدية التنمية والاباضه جريب جريب زرع الأنسجة المبيض وتشير إلى آليات تنظيمية للعمليات الدينامية المبيض.

Abstract

أوفولاتي الإناث الثدييات دورياً على عدد يكاد يكون مستمرا من بويضات خلال كل دورة السفاد. للحفاظ على مثل هذا الانتظام وتواترها، يحدث التنظيم على مستوى محور طائي جوندال الغدة النخامية وعلى تطوير المسام في المبيض. على الرغم من الدراسات النشطة، آليات التنمية المسام ليست واضحة عدة الخطوات التي تنطوي عليها من تنشيط المسام البدائية نائمة للتبويض، وبسبب تعقيد التنظيم التي تختلف في كل مرحلة من مراحل الحبيبي. للتحقيق في آليات التنمية جريب، وديناميات المسام طوال دورة السفاد، قمنا بتطوير نموذج زراعة أنسجة المبيض ماوس التي يمكن استخدامها لمراقبة التنمية المسام باستخدام مجهر. التنمية جريب منتظمة والاباضه دورية الكبدية جريب يمكن جميع تكون مستنسخة في نموذج مثقف المبيض، ويمكن أن تكون شروط الثقافة والتضمين تجريبيا. هنا، علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في دراسة آليات تنظيمية للتنمية المسام وغيرها من الظواهر المبيض.

Introduction

الماوس الإناث المبايض تحتوي على عدة آلاف من المسام1، ونضوج التبويض الدورية حوالي عشر بويضات في كل دورة السفاد. المسام وتصنف إلى عدة مراحل النمو: البدائي، والابتدائي والثانوي، أنترال، وجراب جرافيان، اعتماداً على شكل طبقة الخلايا granulosa المحيطة بكل البويضات. معظم المسام البدائية نائمة، وبعضهم يتم تفعيلها وتنمو لتصبح المسام الأولية في كل دورة السفاد2. بعد المرحلة الثانوية جرابي، تنظمه التنمية جريب أساسا gonadotropins، جرابي تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH). بيد أن التنمية جريب البدائية والأولية بشكل مستقل تروج والآليات التنظيمية التي تحكم هذه المراحل تظل سيئة إينديرستود3،،من45. بالإضافة إلى عوامل النمو والهرمونات، ينظم التفاعلات بين المسام6،7المسام البدائية والأولية. ولذلك، بإجراء تحليلات لديناميات جريب في أنسجة المبيض الماوس، والتحقيق في الآليات التنظيمية المرتبطة باستخدام زرع الأنسجة المبيض8،،من910.

هنا، نحن نقدم طريقتين نموذج زراعة أنسجة المبيض. الأولى تستخدم لتحليل التنمية جريب بقياس مناطق جرابي، ويستخدم الثاني لدراسة الآلية التنظيمية أثناء المبكرة جريب من البدائية إلى المرحلة الثانوية المسام مع الفئران المعدلة وراثيا. لتحليل التنمية جريب، استخدمنا أساسا المبايض فئران الإناث 4-الأسبوع القديمة لأنها تسمح للتصور سهلة للمسام. للحث على الإباضة الدورية ونموذج التنمية في فيفو جريب، نحن استنسخت طفرة LH والاباضه الملاحظة، والكبدية المسام وإفراز الاستراديول تحت ظروف زراعة الأنسجة. تم القبض على الصور لاستزراع المبيض، وتم تحليل عمليات التنمية جريب بتتبع التغييرات في منطقة جرابي. ومع ذلك، في الحقل مشرق تحليلات مجهرية، التمييز بين المسام الأولية البدائية وأوائل الواضح. وبالتالي، قمنا بتطوير أسلوب للكشف عن المسام الصغيرة، والتمييز بين البدائي، الابتدائي، ومثقف جريب الثانوية في أنسجة المبيض باستخدام Oogenesin1 pro3 (Oog1)- 9 والمبايض R26-H2B-مشري الفئران المعدلة وراثيا في الأيام 0 و 4 بعد الولادة11. التعبير Oog1 قابلاً للاكتشاف في بويضات بعد الدخول إلى الانقسام، ويزيد تدريجيا مع التنمية المسام، مما يتيح رصد الانتقال من البدائي للمسام الأولية باستخدام الصور الوقت الفاصل بين أنسجة المبيض مثقف11 ،12. على الرغم من أن قد استخدمت الطرق المورفولوجية لدراسة العوامل التي تنشيط المسام البدائية نائمة13،14،،من1516، التنمية جريب الفسيولوجية في المبيضين صعوبة في مراقبة، ولا تزال آثار العوامل المختلفة أونتشاراكتيريزيد. وصممت أساليب الثقافة الحالية لمعالجة هذه الندرة في الوقت الحقيقي تحليلات عوامل الهدف.

في هذه الدراسة، ونحن تتبع التنمية الحبيبي باستخدام طريقة تصوير الوقت الفاصل بين وتتميز عملية التنمية جريب. لدينا أساليب مبتكرة توفر أداة غير مسبوقة للتحقيق فسيولوجيا المبايض.

Protocol

تم إيواء الفئران في غرفة التحكم بيئياً في 23 ± 1 درجة مئوية مع ح 12 ضوء/12 ح دورة الظلام. بروتوكولات الرعاية الحيوانية وتجارب أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية “التجارب الحيوانية” في جامعة الطب إيشي ووافقت عليها واجب رعاية الحيوانات واستخدام اللجنة. 1-إعداد الثقافة المتوسطة وأطباق <…

Representative Results

ويبين الشكل 1 البروتوكول المتعلق بالتغييرات في وسائل الإعلام أثناء زراعة أنسجة المبيض. وبعد هذا البرنامج، عمرها 4 الأسبوع الممثل المدني الدولي الفئران المبايض مثقف وتصويرها على فترات 24-ح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 2). خلال ثقافة …

Discussion

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوبي جديد لدراسة التنمية جريب في المبيضين الماوس. الأسلوب الأول ينطوي على ثقافة الفئران الكبار المبيض شرائح الأنسجة متبوعاً بتحليلات للتنمية جريب، والثاني ينطوي على استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتصور التنمية جريب المبكرة مرحلة مستقلة تروج. سابقا، استخ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور مينامي ناوجيرو (جامعة كيوتو) لتوفير الفئران Oog1pro3.9 . أيد هذا البحث JSPS (كاكينهي # JP15H06275) ومؤسسة نيتو.

Materials

Follicle stimulating hormone from human pituitary SIGMA F4021
Lutenizing hormone from equine pituitary SIGMA L9773
Penicillin-streptomycin solution Wako Pure Chemical Industries 168-23191
MEM a, GlutaMax, no nucleotides Thermo Fisher 32561037
Glass bottom dish MatTek P35G-0-10-C 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter
Millicell cell culture insert Merck Millipore PICM0RG50 Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE
3.5cm cell culture dishes greiner bio-one 627160
50ml / centrifuge tube with triple seal cap IWAKI 2345-050
Low-profile disposable blades 819 Leica 14035838925
LSM 710 Carl Zeiss Confocal microscope
CellVoyager, CV1000 Yokogawa Electric Corporation Time-lapse imaging
BZ-X700 KEYENCE Time-lapse imaging

References

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

Play Video

Cite This Article
Komatsu, K., Iwase, A., Murase, T., Masubuchi, S. Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (136), e57794, doi:10.3791/57794 (2018).

View Video