Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü
Summary
Yumurtalık dokusu kültürler folikül gelişim, yumurtlama ve folikül atrezi modelleri olarak kullanılabilir ve düzenleyici mekanizmaları dinamik yumurtalık işlemleri gösterir.
Abstract
Memeli kadın düzenli olarak her estrus döngüsü sırasında yumurtalar hemen hemen sabit bir sayıda yumurtlamak. Böyle düzenlilik ve periyodik olarak sürdürmek için düzenleme hipofiz gonad hipotalamik eksen düzeyinde ve follikül yumurtalık içinde geliştirme ortaya çıkar. Etkin çalışmalar rağmen folikül gelişim mekanizmaları çeşitli adımlar uyuyan ilkel folikül etkinleştirme gelen yumurtlama için ve foliküler her aşamada farklı yönetmelik karmaşıklığı yüzünden net değildir. Folikül gelişim mekanizmaları ve köklerinin estrus döngüsü boyunca dinamikleri araştırmak için bir mikroskop kullanarak folikül gelişim gözlemlemek için kullanılabilir bir fare yumurtalık doku kültürü modeli geliştirdi. Sistematik folikül gelişim, periyodik yumurtlama ve folikül atrezi tek kültürlü yumurtalık modelinde çoğaltılabilir ve kültür koşulları deneysel olarak modüle. Burada, biz, folikül gelişim düzenleyici mekanizmaları ve diğer yumurtalık olayları bu yöntemde yararlılığı göstermek.
Introduction
Dişi fare yumurtalık birkaç bin köklerinin1içeren ve düzenli yumurtlama her estrus döngüsü yaklaşık on yumurtalar olgunlaşır. Köklerinin çeşitli gelişim aşamalarında sınıflandırılır: ilkel, İlköğretim, ortaöğretim, antral ve her oosit çevreleyen granulosa hücresel tabaka şeklinde bağlı olarak Graafian köklerinin. En ilkel köklerinin uykuda ve biraz-in onları aktif hale gelir ve her estrus döngüsü2birincil foliküller içine büyümek. İkincil foliküler aşamadan sonra folikül gelişim gonadotropins tarafından uyarıcı hormon (FSH) ve luteinizan hormon (LH) foliküler esas olarak düzenlenir. Ancak, ilkel ve birincil folikül gelişim gonadotropin bağımsız ve bu aşamaların yöneten düzenleyici mekanizmaları kötü inderstood3,4,5kalır. Büyüme faktörleri ve hormonlar ek olarak, ilkel ve birincil folikül köklerinin6,7arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenmiştir. Bu nedenle, biz folikül dinamiklerini analiz mouse ovarium dokularda gerçekleştirilen ve yumurtalık dokusu kültürler8,9,10kullanarak ilişkili düzenleyici mekanizmaları araştırıldı.
Burada, biz iki yumurtalık doku kültürü modeli yöntemleri tanıtmak. İlk foliküler alanlarda ölçüm tarafından folikül gelişim analiz etmek için kullanılır ve ikinci transgenik fareler ile ikincil folikül aşamasına gelen ilkel erken folikül gelişimi sırasında düzenleyici mekanizma incelemek için kullanılır. Çünkü onlar köklerinin kolay görselleştirme için izin folikül gelişim analiz için Biz esas olarak yumurtalık 4 – hafta eski dişi farelerin kullanılır. Periyodik yumurtlama ve modeli içinde vivo folikül gelişim ikna etmek için LH dalgalanma ve gözlenen yumurtlama, folikül atrezi ve doku kültürü koşullar altında estradiol salgılanmasını çoğaltılamaz. Kültürlü yumurtalık görüntüleri ele geçirildi ve folikül gelişim süreçleri izleme değişiklikleri foliküler alanında tarafından analiz edildi. Ancak, parlak alan Mikroskobu analizleri, ilkel ve erken birincil foliküller ayrımı belirsiz. Bu nedenle, biz küçük köklerinin algılayıp birincil, ilkel arasında ayırt etmek için bir yöntem geliştirdi ve ikincil folikül kültürlü yumurtalık dokuları kullanarak Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 ve 0 ile 4 gün sonra Doğum11, R26-H2B-mCherry transgenik fareler yumurtalık. Oog1 ifade mayoz girmesinden sonra yumurta algılanabilir ve folikül gelişimi, ilkel geçiş kültürlü yumurtalık dokusunun11 hızlandırılmış görüntüleri kullanarak birincil köklerinin gözlenmesi izin ile yavaş yavaş artar ,12. Morfolojik yöntemleri uyuyan ilkel köklerinin13,14,15,16etkinleştirmek faktörler eğitim için kullanılan, yumurtalık fizyolojik folikül gelişiminde olsa gözlemlemek, zor ve çeşitli faktörlerin etkilerini uncharacterized kalır. Mevcut kültür yöntemleri bu yetersizlik hedef faktörler gerçek zamanlı analizlerde yönelik olarak tasarlanmıştır.
Bu da çalışmanın, biz foliküler gelişim hızlandırılmış bir görüntüleme yöntemi kullanarak izleniyor ve folikül gelişim süreci ile karakterizedir. Roman yöntemlerimiz yumurtalıkların fizyolojisi soruşturma için benzeri görülmemiş bir aracı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, fare yumurtalıklarda folikül gelişiminde eğitim için iki yeni yöntem geliştirdik. İlk yöntem kültür folikül gelişim analizleri tarafından takip dilimlenmiş yumurtalık yetişkin fareler dokuların içerir ve ikinci ön folikül gelişim gonadotropin bağımsız aşamasında görselleştirmek için hızlandırılmış Imaging kullanımını içerir. Daha önce biz lösemi inhibitör faktörü ve progesteron folikül gelişim8,9üzer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Naojiro Minami (Kyoto Üniversitesi) Oog1pro3.9 fareler verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma JSP’ler (KAKENHI # JP15H06275) ve Nitto Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
