Summary

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.

Abstract

Las hembras mamíferas ovulan periódicamente una cantidad casi constante de ovocitos durante cada ciclo estral. Para sostener tal regularidad y periodicidad, regulación ocurre a nivel de eje hipotalámico-pituitario-gonadal y en el desarrollo de los folículos en el ovario. A pesar de estudios activos, mecanismos de desarrollo del folículo no son claros debido a los varios pasos de la activación del folículo primordial inactiva a la ovulación y debido a la complejidad de la regulación que difiere en cada fase folicular. Para investigar los mecanismos de desarrollo folicular y la dinámica de los folículos durante el ciclo estral, se desarrolló un modelo de cultura de tejido ovárico de ratón que puede ser utilizado para observar el desarrollo folicular utilizando un microscopio. Desarrollo sistemático del folículo, la ovulación periódica y atresia del folículo pueden todas reproducidas en el modelo de ovario cultivadas, y las condiciones de cultivo pueden ser moduladas experimentalmente. Aquí, demostramos la utilidad de este método en el estudio de los mecanismos de regulación del desarrollo folicular y otros fenómenos de ovarianos.

Introduction

Los ovarios de la hembra del ratón contienen varios mil folículos1, y la ovulación periódica madura aproximadamente diez ovocitos en cada ciclo estral. Los folículos se clasifican en varias etapas del desarrollo: primordial, primaria, secundaria, antral y los folículos de Graaf, dependiendo de la forma de la capa celular granulosa que rodean a cada ovocito. La mayoría de los folículos primordiales están inactivos, y algunos de ellos se activan y se convierten en folículos primarios en cada estro ciclo2. Después de la etapa folicular secundaria, desarrollo folicular está regulado principalmente por gonadotropinas, foliculares estimulante hormona (FSH) y hormona luteinizante (LH). Sin embargo, desarrollo del folículo primordial y principal es independiente de la gonadotropina, y los mecanismos de regulación que rigen estas etapas siguen siendo mal inderstood3,4,5. Además de factores de crecimiento y hormonas, el folículo primordial y primario está regulado por las interacciones entre los folículos de6,7. Por lo tanto, se realizaron análisis de la dinámica folicular en los tejidos de ovario de ratón e investigaron los mecanismos de regulación asociados con cultivos de tejido ovárico8,9,10.

Adjunto, presentamos dos métodos del modelo de cultivo de tejido ovárico. El primero se utiliza para analizar el desarrollo del folículo por la medida de áreas foliculares, y la segunda se utiliza para estudiar el mecanismo de regulación durante el desarrollo temprano del folículo de primordial a la etapa de folículo secundario con ratones transgénicos. Para el análisis del desarrollo del folículo, utilizan principalmente ovarios de ratones hembra 4 – semanas de edad debido a que permiten la fácil visualización de los folículos. Para inducir la ovulación periódica y desarrollo de modelos en vivo del folículo, reproducen de LH y la ovulación observada, la atresia del folículo y secreción de estradiol bajo condiciones de cultivo de tejidos. Imágenes de los ovarios cultivados fueron capturados, y los procesos de desarrollo del folículo se analizaron por los cambios de trazado en la zona folicular. Sin embargo, en los análisis de microscopía de campo claro, la distinción entre folículos primordiales y principios primarios era claro. Así, se desarrolló un método para detectar folículos pequeños y distinguir entre el primordial, primario, y folículo secundario en cultiva tejidos ováricos usando Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 y R26-H2B-mCherry ovarios de ratones transgénicos a los 0 y 4 días después del nacimiento11. Oog1 expresión es detectable en ovocitos después de entrada en meiosis y aumenta gradualmente con el desarrollo del folículo, lo que permite la observación de la transición de primordial a primarios folículos con imágenes de Time-lapse de tejido de ovario cultivadas11 ,12. Aunque se han utilizado métodos morfológicos para estudiar factores que activan los folículos primordiales inactivos13,14,15,16, desarrollo fisiológico del folículo en los ovarios es difícil de observar, y los efectos de varios factores siendo desacostumbrados. Los métodos actuales de la cultura fueron diseñados para abordar esta falta en tiempo real Análisis de factores objetivos.

En el presente estudio, con desarrollo folicular utilizando un método de imagen Time-lapse y había caracterizado el proceso de desarrollo folicular. Nuestros nuevos métodos ofrecen una herramienta sin precedentes para la investigación de la fisiología de los ovarios.

Protocol

Ratones fueron alojados en una sala de ambiente controlada a 23 ± 1 ° C con un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Protocolos de cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para la experimentación Animal en la Universidad médica de Aichi y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal titular. 1. preparación de medio de cultivo y platos Para preparar medio de cultivo base, agregar suero bovino fetal (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL…

Representative Results

La figura 1 muestra el protocolo para los cambios en los medios de comunicación en cultura del tejido ovárica. Siguiendo este programa, ovarios de ratones ICR 4 semanas de edad fueron cultivadas e imagen a intervalos de 24 h mediante microscopía confocal (figura 2). Durante el cultivo de tejidos de ovario durante 3 semanas, más folículos antrales y secundarios fueron degenerados por atresia del folículo y algunos fueron ovu…

Discussion

En este estudio, hemos desarrollado dos nuevos métodos para estudiar el desarrollo folicular en ovarios de ratón. El primer método implica el cultivo de los tejidos de ratones adultos ovárico en rodajas seguida por análisis del desarrollo del folículo, y el segundo involucra el uso de Time-lapse de imágenes para visualizar el desarrollo folicular temprano durante la etapa independiente de la gonadotropina. Anteriormente, utiliza el método de cultivo de tejidos de ovario presente para evaluar el efecto del factor …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dr. Naojiro Minami (Universidad de Kioto) para proporcionar los ratones Oog1pro3.9 . Esta investigación fue apoyada por el JSP (KAKENHI # JP15H06275) y la Fundación de Nitto.

Materials

Follicle stimulating hormone from human pituitary SIGMA F4021
Lutenizing hormone from equine pituitary SIGMA L9773
Penicillin-streptomycin solution Wako Pure Chemical Industries 168-23191
MEM a, GlutaMax, no nucleotides Thermo Fisher 32561037
Glass bottom dish MatTek P35G-0-10-C 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter
Millicell cell culture insert Merck Millipore PICM0RG50 Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE
3.5cm cell culture dishes greiner bio-one 627160
50ml / centrifuge tube with triple seal cap IWAKI 2345-050
Low-profile disposable blades 819 Leica 14035838925
LSM 710 Carl Zeiss Confocal microscope
CellVoyager, CV1000 Yokogawa Electric Corporation Time-lapse imaging
BZ-X700 KEYENCE Time-lapse imaging

References

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

Play Video

Cite This Article
Komatsu, K., Iwase, A., Murase, T., Masubuchi, S. Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (136), e57794, doi:10.3791/57794 (2018).

View Video