Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

MNs de la colonne vertébrale sont la partie du système nerveux central mais innervent des muscles périphériques pour contrôler le mouvement. Dans la pays en développement de la moelle épinière, progéniteurs MN (PMN) sont établis selon les signaux émanant de la notochorde et des somites adjacents. Toutes différencient MNs post-mitotiques sont ensuite générés à partir de PMN, éventuellement donnant lieu à une série de sous-types de MN le long de l’axe Rostro de la moelle épinière^1,2. La colonne vertébrale MNs sont topographiquement et anatomiquement bien organisés. Leur arrangement morphologique est en corrélation avec la position de leurs cibles respectives dans la périphérie de³. En atteignant leurs objectifs de muscle, axones recevoir des facteurs neurotrophiques cellulaires et exogènes que les inciter à s’étendre et de la branche plus loin dans les muscles. Innervation et défauts ramifications peuvent contribuer à l’échec pour former des jonctions neuromusculaires (NMJ). Par exemple, des facteurs neurotrophiques gliales (GDNF)-Pea3 induite est indispensable pour ces axones dans maximus cutanée (CM) et^4,5les muscles grand dorsal (LD). En outre, des embryons de souris knock-out DINE montrent défectueuse arborisation des nerfs phréniques dans le diaphragme, provoquant la mortalité et une insuffisance respiratoire immédiatement après la naissance de^6,7. Cette dernière étape de maturation de MN (c.-à-d., projection axonale et ramification) est donc essentielle pour assurer la communication entre les neurones et les cellules cibles.

Pour afficher les modèles de l’arborisation, chercheurs procéder normalement à imagerie confocale ou microscopie de fluorescence biphotonique sectionnés ou entier-montent des échantillons^8,9,10. Deux de ces techniques de microscopie génèrent acceptable résolution et profondeur de pénétration. Microscopie de fluorescence biphotonique implique l’excitation des fluorophores par absorption simultanée de deux photons de faible énergie,¹¹. Puisque l’excitation biphotonique utilise le rayonnement infrarouge, la fréquence d’excitation baisse contribue à la diffusion réduite et meilleure pénétration tissulaire jusqu’à 1 mm dans les tissus, permettant ainsi l’imagerie avec une plus grande profondeur. Microscopie confocale supprime par les filtres de signaux de l’out-of-focus et recueille uniquement la lumière dans le plan focal¹². Avec cette approche, images des échantillons provenant des plans focaux différents peuvent être combinés pour produire une image tridimensionnelle de (3D) via une fonction de Z-pile. Néanmoins, intensité du signal est réduite car la plupart de la lumière est bloquée et les ouvertures numériques hautes obscurcir la profondeur de champ. Plus important encore, les deux techniques contribuent au photovieillissement sévère et phototoxicité puisque l’échantillon entier reçoit illumination même lorsque qu’un avion est imagé à un moment donné.

Pour contourner ces lacunes, LSFM est devenu une alternative favorisée, avec l’avantage d’être rapide et efficace à la lumière et les moins phototoxique^13,14. En outre, LSFM permet l’imagerie multi-vues. Cette approche est particulièrement adaptée à la visualisation des axones moteurs et leurs terminaux de dispersion comme ils se propagent dans l’espace 3D. LSFM surpasse les deux autres options parce que les échantillons sont montés sur une scène qui permet la rotation autour d’un axe vertical et les mouvements le long des x, y et les axes z. Cette configuration permet non seulement pour une vue bloqué au minimum de l’échantillon, mais aussi le choix d’un chemin de l’illumination souhaitable, une lacune de la microscopie biphotonique et confocale, qui nécessitent le montage d’échantillons sur une lame plate. LSFM est donc l’outil plus approprié pour l’imagerie 3D d’arborisation axon et pour la quantification des terminaisons nerveuses moteur dans des embryons de souris.