Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.
Abstract
Os neurônios motores da coluna vertebral (MNs) estender seus axônios para se comunicar com seus alvos innervating, assim, controlar movimentos e tarefas complexas em vertebrados. Assim, é fundamental para descobrir os mecanismos moleculares de como motor axônios navegue até aterraplenar e inervam os seus músculos periféricos alvos durante o desenvolvimento e degeneração. Apesar de linhas de rato transgénicas Hb9::GFP tem servido por muito tempo a visualização trajectórias axônio motor durante o desenvolvimento embrionário, descrições detalhadas de todo o espectro de arborização terminal axônio permanecem incompletas devido à complexidade do teste padrão e limitações de microscopia óptica atual. Aqui, descrevemos um protocolo melhorado que combina microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) e análise de imagem robusta, qualitativa e quantitativamente Visualizar desenvolvimento motor axônios. Este sistema pode ser facilmente adotado para cruzar mutantes genéticos ou modelos de doença MN com linhas Hb9::GFP , revelando novos mecanismos moleculares que levam a defeitos de navegação axônio motor e arborização.
Introduction
MNs da coluna vertebral são a parte do sistema nervoso central mas inervam músculos periféricos para controlar o movimento. Na medula espinhal em desenvolvimento, progenitores de MN (PMN) são estabelecidas de acordo com os sinais que emana a notocorda e somitas adjacentes. Todos diferenciados MNs pós mitóticas então gerados a partir de PMN, eventualmente, dando origem a uma série de subtipos de MN ao longo do eixo de rostrocaudal da medula espinhal,1,2. MNs espinhais são topograficamente e anatomicamente bem organizados. Seu arranjo morfológico correlaciona-se com a posição de seus respectivos na periferia3. Ao atingir suas metas de músculo, axônios recebem fatores celulares e exógena neurotrophic que induzem-los a estender e um ramo ainda mais em músculos. Inervação e ramificação defeitos podem contribuir para a falha para formar junções neuromusculares (JNM). Por exemplo, fatores de neurotrófico derivado de glia (GDNF)-Pea3 induzido é indispensável para a arborização de axônio em cutâneo maximus (CM) e latissimus dorsi (LD) músculos4,5. Além disso, embriões de rato de nocaute DINE mostram defeituosa arborização dos nervos frênico no diafragma, causando mortalidade e insuficiência respiratória, imediatamente após o nascimento,6,7. Portanto, esta última etapa de maturação MN (ou seja, projeção axonal e ramificação) é fundamental para garantir a comunicação entre os neurônios e células-alvo.
Para ver os padrões de arborização, pesquisadores normalmente conduzir imagem latente confocal ou microscopia de luz de dois fotões de fluorescência das amostras seccionado ou toda a montagem8,9,10. Ambas estas técnicas de microscopia geram aceitável resolução e profundidade de penetração. Microscopia de fluorescência de dois fotões de luz envolve excitação de fluorophores por absorção simultânea de dois fótons de baixa energia11. Desde que dois fotões excitação usa radiação infravermelha, a frequência de diminuição da excitação contribui para a dispersão reduzida e melhor penetração de tecido até 1 mm de tecido, permitindo imagens com maior profundidade. Microscopia confocal remove pelos filtros do fora-de-foco sinais e apenas recolhe a luz dentro do plano focal12. Com esta abordagem, imagens das amostras dos diferentes planos focais podem ser combinadas para produzir uma imagem de tridimensional (3D) através de uma função de Z-pilha. Não obstante, intensidade de sinal é reduzida como a maioria da luz é bloqueada e altas aberturas numéricas obscurecem o profundidade de campo. Mais importante, ambas as técnicas contribuem para a grave Fotodano e fototoxicidade desde o espécime recebe iluminação mesmo quando apenas um avião é fotografado em um determinado momento.
Para contornar essas deficiências, LSFM tornou-se uma alternativa favorecida, com as vantagens de ser rápido, luz eficiente e menos fototóxico13,14. Além disso, o LSFM permite múltipla visualização imagem. Esta abordagem é particularmente adequada para visualização motor axônios e seus terminais de dispersão como eles se espalharam através do espaço 3D. LSFM supera as outras duas opções, porque as amostras são montadas em um palco que permite a rotação em torno de um eixo vertical e movimentos ao longo o x, y e z eixos. Esta montagem não só permite uma visão minimamente bloqueada da amostra, mas também a escolha de um caminho de iluminação desejável, uma lacuna de microscopia confocal e de dois fotões, ambos dos quais requerem montagem de amostras em uma corrediça plana. Portanto, LSFM é a ferramenta mais adequada para imagens 3D de arborização de axônio e para a quantificação dos terminais do nervo motor em embriões do rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversas etapas no protocolo podem ser sujeitas a alterações em determinadas circunstâncias. Por exemplo, a duração da fixação depende da idade dos embriões, variando entre 2 h e 1 ou mais dias usando paraformaldeído acabadas. Desde que a fixação é feita antes de toda montagem imunocoloração, para anticorpos que são sensíveis à proteínas de reticulação, metanol pode ser usado como um agente fixador alternativo. Para uma relação sinal / ruído elevada após coloração, é necessário otimizar a conc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM experimentos e análise de dados foram realizadas em parte usando os avançados microscópios óticos do divisão de instrumento serviço na Academia Sinica e com o auxílio do MS. Shu-Chen Shen. Agradecemos a Sra. Sue-Ping Lee do Imaging Core Facility do IMB considerável assistência técnica com análise de imagem hottie. Científico Inglês edição núcleo do IMB reviu o manuscrito. Este trabalho é financiado pela Academia Sinica prêmio de desenvolvimento de carreira (CDA-107-L05), mais (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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