Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo’s. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo’s voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.
Abstract
Spinale motorische neuronen (MNs) breiden hun axonen om te communiceren met hun innervating doelen, waardoor beheersing van beweging en complexe taken in gewervelden. Het is dus van cruciaal belang voor het ontdekken van de moleculaire mechanismen van hoe motor axonen Navigeer naar arborize en hun perifere spier innervate richt zich tijdens het ontwikkelen en degeneratie. Hoewel transgene Hb9::GFP muis lijnen lang diende hebben te visualiseren motor axon trajecten tijdens de embryonale ontwikkeling, gedetailleerde beschrijvingen van het volledige spectrum van axon terminal arborization onvolledig als gevolg van de complexiteit van de patroon blijven en beperkingen van de huidige optische microscopie. Hier beschrijven we een verbeterde protocol dat combineert licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) en robuuste beeldanalyse kwalitatief en kwantitatief visualiseren ontwikkelen van motorische axonen. Dit systeem kan gemakkelijk worden vastgesteld om het Kruis genetische mutanten of MN ziekte modellen met Hb9::GFP lijnen, onthullende roman moleculaire mechanismen die tot defecten in motor axon navigatie en arborization leiden.
Introduction
Spinale MNs zijn het deel van het centrale zenuwstelsel maar innervate perifere spieren om te controleren van de beweging. De ontwikkelende ruggenmerg, zijn volgens de signalen afkomstig van de chorda en de aangrenzende somieten MN progenitoren (pMNs) gevestigd. Alle post mitotische MNs gedifferentieerd zijn vervolgens gegenereerd op basis van pMNs, die uiteindelijk aanleiding geven tot een reeks van MN subtypen langs de as van de rostrocaudal van het ruggenmerg1,2. Spinale MNs zijn topografisch en anatomisch goed georganiseerd. Hun morfologische overeenkomst correleert met de positie van hun respectieve doel in de periferie-3. Bij het bereiken van hun doelen spier, axonen ontvangen neurotrophic cellulaire en exogene factoren die veroorzaken ze uit te breiden en tak verder in spieren. Innervatie arm en vertakkende gebreken kunnen bijdragen aan het uitblijven van neuromusculaire kruispunten (NMJ) vormen. Bijvoorbeeld gliale-afgeleide neurotrophic factoren (GDNF)-geïnduceerde Pea3 is onmisbaar voor axon arborization in cutane maximus (CM) en latissimus dorsi (LD) spieren4,5. Bovendien, tonen DINE knockout muis embryo’s defecte arborization van phrenic zenuwen in het middenrif, respiratoir falen en mortaliteit veroorzaakt onmiddellijk na de geboorte6,7. Deze laatste stap van MN rijping (d.w.z., axonale projectie en vertakking) is daarom van cruciaal belang om communicatie tussen de neuronen en doelcellen.
Als u wilt bekijken arborization patronen, gedrag onderzoekers normaal confocal imaging of de lichte microscopie van de twee-foton fluorescentie van verdeelde of geheel-mount monsters8,9,10. Beide microscopie technieken genereren aanvaardbare resolutie en diepte penetratie. De lichte microscopie van twee-foton fluorescentie omvat excitatie van fluorophores door gelijktijdige absorptie van twee lage-energie fotonen11. Aangezien twee-foton excitatie nabij-infrarood straling gebruikt, bijdraagt de verminderde excitatie-frequentie aan verminderde verstrooiing en betere weefsel penetratie tot 1 mm in weefsel, waardoor beeldbewerking met meer diepte. Confocale microscopie verwijdert u door filters de out-of-focus signalen en verzamelt enkel licht binnen het brandvlak12. Met deze aanpak, kunnen beelden van monsters van verschillende focale vlakken worden gecombineerd voor de productie van een driedimensionaal (3D) beeld via de functie van een Z-stack. Niettemin, signaalsterkte wordt verminderd, zoals de meeste van het licht wordt geblokkeerd en hoge numerieke openingen de diepte-van-veld verdoezelen. Nog belangrijker, bijdragen beide technieken tot de ernstige photodamage en fototoxiciteit aangezien het hele model verlichting, krijgt zelfs wanneer slechts één vliegtuig is beeld op een bepaald moment.
Om te omzeilen deze tekortkomingen, LSFM een favoriet alternatief, met de voordelen van het snel en licht-efficiënt, en minder fototoxische13,14geworden. Verder staat LSFM Multi-View imaging. Deze aanpak is bijzonder geschikt voor het visualiseren van motorische axonen en hun verspreiden terminals zoals ze verspreid via 3D-ruimte. LSFM beter presteert dan de andere twee opties omdat monsters zijn gemonteerd op een podium waarmee rotatie rond een verticale as en bewegingen langs de x-, y- en z-assen. Niet alleen kunt deze set-up voor een minimaal geblokkeerde weergave van het monster, maar ook de keuze van een wenselijk verlichting pad, een tekortkoming van de twee-foton en confocal microscopie, die beide montage van monsters op een vlakke dia vereisen. LSFM is daarom het meest geschikte instrument voor 3D beeldvorming van axon arborization en kwantificering van de terminals van de motorische zenuw in muis embryo’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende stappen in het protocol kunnen worden onderworpen aan wijzigingen onder bepaalde omstandigheden. De duur van fixatie hangt bijvoorbeeld af van de leeftijd, van de embryo’s, variërend van 2 h tot 1 of meer dagen met behulp van vers-en-klare paraformaldehyde. Aangezien de fixatie wordt uitgevoerd vóór de hele berg immunokleuring, op antilichamen die gevoelig voor eiwit crosslinking zijn, kan methanol worden gebruikt als een alternatieve kleefpoeders agent. Voor een hoge signaal-/ ruisverhouding na kleuring…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM experimenten en data-analyse werden uitgevoerd gedeeltelijk met behulp van de geavanceerde optische microscopen van de afdeling van de dienst van de Instrument in de Academia Sinica en met de hulp van Ms. Shu-Chen Shen. Wij danken mevrouw Sue-Ping Lee van de Imaging Core faciliteit van IMB voor aanzienlijke technische bijstand met Imaris beeldanalyse. Van de IMB wetenschappelijke Engelse bewerken Core herzien het manuscript. Dit werk wordt gefinancierd door de Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), meest (104-2311-B-001-030-MY3) en NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
