モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化
Summary
ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション プロセスに適用されます。
Abstract
運動と脊椎動物の複雑なタスクを制御の支配のターゲットと通信するための軸索を脊髄運動ニューロン (MNs) に拡張します。したがって、どのようにモーター軸索に移動、arborize とその周辺の筋肉を刺激するターゲット開発と変性の間の分子機構を明らかにするため重要です。Hb9::GFPマウスの遺伝子組み換えの行は、萌芽期の開発の間にモーター軸索の軌跡を視覚化する提供して長い軸索ターミナル楔形の完全なスペクトルの詳細な説明のパターンの複雑さのため不完全なまま、現在の光学顕微鏡の限界。ここでは、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) と, 定性的かつ定量的視覚化モータ軸索を開発するロバストな画像解析を組み合わせた改良されたプロトコルについて述べる。このシステムは、遺伝的変異体またはミネソタ病気モデルHb9::GFP線、モーター軸索ナビゲーションおよび楔形の欠陥につながる新規の分子メカニズムを明らかに越えるに簡単に適用できます。
Introduction
脊髄 MNs は中枢神経系の一部が、動きを制御する末梢の筋肉を刺激します。発展途上の脊髄における MN 前駆細胞 (Pmn) は脊索と隣接する体節から発せられる信号によって確立されます。ポスト mitotic の MNs を区別すべてが最終的に一連の脊髄1,2rostrocaudal 軸 MN サブタイプに上昇を与える Pmn から生成されます。脊髄 MNs 地形的、解剖学的にも整理されています。周囲3の彼らのそれぞれのターゲットの位置と相関する形態での配置。その筋の目標に達して、時に軸索を受信を拡張し、分岐するように誘導する細胞および外因性神経栄養因子の筋肉にさらに。分岐の欠陥と神経支配神経筋接合部 (NMJ) を形成する失敗に貢献するかもしれない。たとえば、グリア由来神経栄養因子 (GDNF)-誘導 Pea3 は皮膚大殿 (CM) に軸索分枝に不可欠なと広背筋 (LD) 筋肉4,5。さらに、食事ノックアウト マウス胚は誕生6、7の直後に呼吸障害や死亡の原因と、横隔膜の横隔神経の欠陥の分枝を示します。したがって、MN 成熟 (すなわち、軸索投射および分岐) のこの最後のステップは、神経細胞と標的細胞の間の通信を確保する重要です。
分枝パターンを表示するのには研究者では、共焦点レーザー顕微鏡や断面、ホール マウント標本8,9,10の 2 光子蛍光顕微鏡が行う通常。これらの顕微鏡検査の技術の両方を許容解像度と深度貫入を生成します。2 光子蛍光顕微鏡は、2 つの低エネルギー光子11の同時吸収による蛍光物質の励起を含みます。2 光子励起近赤外放射を使用するので減少励起周波数は減らされた散乱と最大 1 mm 以上の深さでイメージングできるように組織のより良い組織浸透に貢献します。共焦点顕微鏡は、焦点のずれた信号し、フォーカル プレーン12内の光を収集するだけのフィルターによって削除します。このアプローチでは、Z スタック関数を介して三次元 (3 D) 画像を生成する別の焦点面からのサンプルの画像を結合できます。それにもかかわらず、光の大部分はブロックされ、高い数値の開口部あいまいなフィールドの深さと、信号強度が低下します。もっと重要なは、両方の技術は重度の生成や毒性に貢献する時点で一枚の平面のイメージが作成された場合でも、全体の標本が照明を受け取るので。
これらの欠点を回避するために LSFM は、支持された代わりに、高速、光効率の高い, という利点を持つと以下の光毒性13,14になっています。さらに、LSFM は、多視点画像をことができます。このアプローチは、3 D 空間で広まったモータ軸索と分散端末を可視化に特に適しています。サンプルは縦の軸線および x、y、および z 軸に沿って動きの周りの回転を可能にするステージ上にマウントされるため、LSFM は他の 2 つのオプションを上回ります。このセットアップだけでなく、両者フラット スライド上のサンプルの実装サンプルの最小ブロック表示が、また望ましい照明パス、2 光子および共焦点の顕微鏡検査の欠点の選択ことができます。したがって、LSFM は軸索分枝の 3 D 画像処理およびマウス胚における運動神経終末の定量化のための最適なツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
特定の状況で変更は、プロトコルのいくつかの手順を受ける場合があります。たとえば、固定の期間はたてパラホルムアルデヒドを使用して 1 つ以上の日に 2 h から様々 な胚の年齢によって異なります。抗体タンパク質架橋に敏感なため、全体のマウント染色前に固定されるので、代替の固定剤としてメタノールを使用できます。染色時に高い信号対雑音比、洗剤の濃度を最適化する必要が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM 実験とデータ解析をさん・ シュー-chen シェンの援助と中央研究院の一部で楽器サービス部門の高度な光学顕微鏡を使用して行った。イメージング コア施設の IMB の Imaris 画像解析にかなりのテクニカル サポートからスー Ping リーさんに感謝いたします。IMB の科学英語編集コアは、原稿を検討しました。この作品は NHRI (NHRI-EX106-10315NC)、(104-2311-B-001-030-MY3) 最もアカデミア シニカ キャリア ・ デベロップメント賞 (CDA-107-L05) によって資金を供給します。
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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