Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación
Summary
Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.
Abstract
Neuronas de motor espinales (MNs) extienden sus axones a comunicarse con sus objetivos innervating, así control de movimiento y las tareas complejas en vertebrados. Por lo tanto, es fundamental para descubrir los mecanismos moleculares de cómo motor axones vaya a arborize y estimular su músculo periférico orienta durante el desarrollo y la degeneración. Aunque de líneas transgénicas de ratón Hb9::GFP durante mucho tiempo han servido para visualizar trayectorias de motor axón durante el desarrollo embrionario, descripciones detalladas de todo el espectro de la arborización terminal del axón permanecen incompletas debido a la complejidad del patrón y limitaciones de la microscopía óptica actual. Aquí, describimos un protocolo mejorado que combina la microscopia de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (LSFM) y análisis de imagen robusta cualitativa y cuantitativamente visualizar desarrollo motor axons. Este sistema puede ser fácilmente adoptado para cruzar mutantes genéticos o modelos de la enfermedad de MN con Hb9::GFP líneas, revelando nuevos mecanismos moleculares que conducen a defectos en la navegación del axón motor y arborización.
Introduction
MNs espinales son parte del sistema nervioso central pero inervan músculos periféricos para controlar el movimiento. En la médula espinal en desarrollo, progenitores de MN (pMNs) se establecen según las señales que emanan de la notocorda y somitas adyacentes. Todos distinguen MNs poste-mitotic se generan luego de pMNs, eventualmente dando lugar a una serie de subtipos de MN en el eje rostrocaudal de la médula espinal1,2. MNs espinales están organizadas topográficamente y anatómicamente bien. La disposición morfológica se correlaciona con la posición de sus respectivos objetivos en la periferia3. Al llegar a sus objetivos de músculo, axones reciben factores neurotróficos exógenos y celular que inducen a extenderse y ramificarse en los músculos. Inervación y ramificación defectos pueden contribuir a la falla para formar a uniones neuromusculares (NMJ). Por ejemplo, factores de neurotrophic glial-derivado (GDNF)-Pea3 inducida es indispensable para la arborización de axon en maximus cutáneos (CM) y4,5de los músculos latissimus dorsi (LD). Además, embriones de ratón knockout DINE muestran defectuosa arborization de nervios frénicos en el diafragma, causando mortalidad y fallo respiratorio inmediatamente después del nacimiento6,7. Por lo tanto, este último paso de la maduración de la MN (por ejemplo, proyección axonal y ramificación) es fundamental para asegurar la comunicación entre las neuronas y las células diana.
Para ver los patrones de la arborización, los investigadores normalmente realizan proyección de imagen confocal o microscopía de fluorescencia de dos fotones de muestras seccionadas o conjunto de montaje8,9,10. Ambas de estas técnicas de microscopía generan aceptable resolución y profundidad de penetración. Microscopía de fluorescencia de dos fotones consiste en la excitación de fluoróforos por absorción simultánea de dos fotones de menor energía11. Puesto que la excitación de dos fotones utiliza la radiación infrarroja, la frecuencia de excitación disminuida contribuye a la dispersión reducida y mejor penetración del tejido hasta 1 mm de tejido, permitiendo la proyección de imagen con mayor profundidad. La microscopia confocal quita filtros fuera de enfoque de señales y sólo recoge la luz dentro del plano focal12. Con este enfoque, imágenes de muestras de diferentes planos focales pueden combinarse para producir una imagen tridimensional (3D) mediante una función de Z-stack. Sin embargo, intensidad de la señal se reduce ya que la mayoría de la luz es bloqueada y aberturas numéricas alta ocultar la profundidad de campo. Más importante aún, ambas técnicas contribuyen al fotoenvejecimiento severo y fototoxicidad puesto que la muestra entera recibe iluminación incluso cuando sólo un plano es reflejado en un momento dado.
Para evitar estas deficiencias, LSFM se ha convertido en una alternativa favorecida, con las ventajas de ser rápido y eficiente a la luz y menos fototóxico13,14. Además, LSFM permite la proyección de imagen multi-view. Este enfoque es particularmente adecuado para visualizar motor axons y sus dispersión terminales ya que esparcir a través del espacio 3D. LSFM supera a las otras dos opciones ya que las muestras se montan en un escenario que permite una rotación alrededor de un eje vertical y los movimientos a lo largo de la x, y y z ejes. Este montaje no sólo permite una visión mínimamente bloqueada de la muestra sino también la elección de un camino de iluminación conveniente, un defecto de la microscopia confocal y de dos fotones, que requieren el montaje de muestras en una lámina plana. Por lo tanto, LSFM es la herramienta más apropiada para la proyección de imagen 3D de arborización de axón y para la cuantificación de los terminales de los nervios motores en embriones de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios pasos en el protocolo pueden ser sometidos a cambios en determinadas circunstancias. Por ejemplo, la duración de la fijación depende de la edad de los embriones, variando de 2 h a 1 o más días utilizando paraformaldehido recién hechos. Puesto que la fijación se lleva a cabo antes de la inmunotinción de Monte todo, para los anticuerpos que son sensibles a la proteína reticulación, metanol puede utilizarse como un agente fijador alternativo. Para un alto cociente signal-to-noise a la coloración, es necesar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM experimentos y análisis de datos se realizaron en parte con los microscopios ópticos avanzados de la división de servicio instrumento de Sinica de la Academia y con la asistencia de la Sra. Chen Shu Shen. Agradecemos a la Sra. Sue-Ping Lee de la proyección de imagen núcleo centro de IMB considerable asistencia técnica con Imaris análisis de imagen. Inglés edición base de IMB científica revisó el manuscrito. Este trabajo es financiado por el Premio de desarrollo de carrera Academia Sinica (CDA-107-L05), más (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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