. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

GABAergic קורטיקלית interneurons (INs) מגוונים לגבי תכונותיהם הביוכימי, מאפיינים פיזיולוגיים וקישוריות, ולסיים הם פונקציות שונות רשתות בוגר^{1,2,3 ,4,5}. המפרט של תתי סוגים שונים של תוספות קורטיקלית מוסדר בחוזקה דרך מפלי גנטי כי כבר למדה בהרחבה^1,2. הרוב (70%) של תוספות GABAergic קורטיקלית מקורן אבות ב המדיאלי ganglionic קדושתו (MGE), מבנה עובריים ממוקם ventrally, ו עליך להעביר על פני מרחקים ארוכים יחסית כדי להגיע את צלחת קורטיקלית^{1, 2 , 6}. בזמן תאים קורטיקליים כפירמידה להעביר בצורה רדיאלית מאזור חדרית (VZ) לצלחת קורטיקלית לאורך לגרדום עכשיו רדיאלי, דונלד, ההעברה וקולו של תוספות, אשר לא צורפו כזה גרדום, דורש מגוון מהותי ו הסימנים החיצוניים כדי למשוך נוירונים נודדים כלפי הלוח בקליפת המוח, בזמן מנחה אותם הרחק מבני קורטיקלית-^2,–^7,–⁸. לאחר היציאה מחזור התא, תוספות הם שמופץ מ MGE על-ידי רמזים כימותרפיה-דוחה הביע בתוך VZ של MGE, אשר מפעיל העברה משיק לקראת^9,קורטיקלית צלחת¹⁰. העברת תוספות למנוע את סטריאטום בעזרת רמזים שונים דוחה¹¹ והם, כשמגיעים לצלחת קורטיקלית, להחליף בין וקולו מצב ההעברה רדיאלי להגיע אל המיקום למינריות הסופי שלהם, חלקית בתגובה רמזים של פירמידה תאים¹² ו אחרים אוכלוסיות הסלולרית¹³. ההעברה של In, עבור אוכלוסיות עצביים אחרים, כרוך שינויים מורפולוגיים דינמיים שונים להתיר תנועת בפועל של הנוירון. ומכניקה עצביים כביכול זו מאופיינת מחזורים חוזרות של שלושה שלבים רצופים: התארכות של תהליך מוביל, של תנועה anterograde פעיל של הגרעין (nucleokinesis), משיכת תהליך נגרר¹⁴. בהעברה מוסדר על ידי רמזים רבים פנימי ולא חיצוני להסיע את מסעף ו שיפוץ פעיל של התהליך מוביל להנחות הארצי בכיוון הנכון, קביעת כיוון ומהירות ההעברה^{14,15 ,16}.

גורמים ויסות קורטיקלית בהעברה נחקרו בהרחבה בשנים האחרונות^{1,2,7,17,18,19,20}, יש כבר שמהווה שיבוש בחלק מן השחקנים מולקולרית להוביל להפרעות התפתחותיות, כגון רפואת ילדים עקשן אפילפסיה או אוטיזם ספקטרום הפרעות^{1,2,21, 22 , 23 , 24}. לפיכך, הפיתוח של גישות שונות במבחנה , ויוו יש כנראה תפס לקדם בצורה משמעותית את היכולת שלנו ללמוד תהליך דינמי זה, כפי שנבדקו בעבר²⁵. במבחנה שיטות, כולל וזמינותו קאמרית בוידן, פס בחירה וזמינותו, לספק את האמצעים והמהירה ביותר לשחזור להעריך את הדרישה וההשפעה התא האוטונומי של גנים ספציפיים או חלבונים במהלך ההעברה עצביים, ללא השפעת גורמים אחרים²⁵. אלה מבחני שימושיות במיוחד בשילוב עם הדמיה live^8,26,27. עם שיטות אלה, הן בקלות שאוחזר מ- e13.5 MGE והתבניות מבודדת על ידי דיסוציאציה אנזימטי ועל מכניים, אחרי אשר איתות המסלולים שונה, הדרכה רמזים יכול ייחקרו, כמופיע בעבר^8,28 . עם זאת, אלה מבחני לקחת את המקום מטריצה חוץ-תאית מלאכותי בהיעדרו של רקמות תלת מימדי אדריכלות, אשר עשוי לשנות מאפייני התנהגות של תאים עצביים, פוטנציאל להשפיע תא העברה ו/או הישרדות²⁵. כדי לעקוף את מגבלות אלה, פותחו vivo לשעבר MGE explants ככלי חלופי כדי לכמת את השינויים מורפולוגי דינמיים המתרחשים במהלך ההעברה יחד עם פרמטרים כגון מהירות וכיוון^{14, 29}. MGE explants הוא יחסית פשוט ושוויונית כבר בהרחבה תיאר במקום³⁰. היא מצריכה את ציפוי של תמצית קטנה של MGE על טפט של תאים קורטיקליים מעורבת, או בתערובת של matrigel וקולגן בנוכחות רמזים מושך או דוחה²⁵, למרות האחרונים הם אופציונליים³¹. MGE explants לאפשר רזולוציה גבוהה הדמיה של תאים עם תוויות בדלילות, לפשט את המחקר של תהליכים תאיים, כגון שיפוץ cytoskeletal בתהליך המוביל הסתעפות, כפי שמוצג בעבר^{32,33 ,34} , במחקר הנוכחי. MGE explants שימשו בהצלחה כדי להעריך שינויים cytoskeletal דינמי במהלך ההעברה בסביבה דו-מימדית, למשל לאחר ספציפי מניפולציות תרופתי או chemotactic (ראה, לדוגמה, Tielens. ואח 2016³³) . אולם, עם גישה זו, תוספות להעביר במסגרת מלאכותי, זה עשוי לשנות ב התנהגות הפארמצבטית ואת המשמעות של תוצאות הניסוי.

לעומת זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר מניפולציה גנטית של תוספות בסביבתם הטבעית, היא שיטה הנפוצה להעריך במהירות וביעילות את ההשפעה של רווח הפסד של תפקוד הגן תוך עקיפת המגבלות של נוקאאוט יקר וארוך, טוק-in אסטרטגיות^25,35. אלקטרופורציה בתוך הרחם עלולים להיות מוטים לכיוון בבית אבות באמצעות תא סוג ספציפי היזמים ועל ידי מיקום האלקטרודות לכיוון מבני ventromedial, כולל את MGE³⁶. יתר על כן, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר ביטוי בזמן של בונה ניסיוני בתוך 1-2 ימים, לעומת 7-10 ימים נדרש לבנות ביטוי באמצעות ויראלי המומנט²⁵. עם זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה של בבית אבות נוטה להיות תפוקה נמוכה. למרות אבות תא כפירמידה ממוקם באזור הגבי חדרית יכולה להיות transfected ביעילות באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה, פילוח יותר ventrally ממוקם מבנים, כגון MGE, הוא יותר מבחינה טכנית מאתגר, בפרט קטן e13.5 עוברי, השיעור הגבוה של עובריים קטלני עוד יותר מפחית את התשואה ניסיוני²⁵.

כדי לעקוף חלק המגבלות הטכניות הקשורות במבחנה MGE explant הניסויים ולא אלקטרופורציה ויוו ברחם , שמחוץ organotypic פרוסה תרבויות היה מפותח^{8,37, 38,39}. המוח organotypic פרוסה תרבויות מציעים תנאים היתרון מחקה ויוו , בעת היותו פחות יקרים ולגזול מאשר חיה ביצירת מודלים²⁵. אכן, הכנות אלה מאפשרים גישה נוחה MGE, יחד עם הפריט החזותי ספציפי של תוספות, ולא יכול להיות משולב עם מוקד אלקטרופורציה לחקור מסלולים מולקולריים ספציפי ב- INs נודדות סביבה יותר פיזיולוגית^{8 , 39 , 40 , 41}. אנחנו ולכן יש אופטימיזציה גישה עבור organotypic תרבויות³⁸, אשר אנחנו בשילוב עם רחם לשעבר אלקטרופורציה והדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, בכדי להעריך את תהליך דינמי מורפולוגיים המתרחשים במהלך ההעברה וקולו של MGE-In. בפרוטוקול הנוכחי הותאם וממוטב אחרים אשר השתמשו לשעבר הרחם או בתוך הרחם המוח אלקטרופורציה organotypic פרוסה תרבויות ללמוד את ההעברה של תאים כפירמידה^42,43 ו בקליפת המוח תוספות^36,39,44. באופן ספציפי, העכבר העוברים נמצאים ערף, MGE הוא electroporated vivo לשעבר לאחר הזרקה ע של פלסמידים ניסיוני, ומאפשר יותר יעיל, מדויק פילוח של אבות MGE מאשר מה ניתן להשיג באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . המוח ואז מופקים למחלקה לפרוסות הילתית כל המוח זה יכול להיות תרבותי לכמה ימים, ובכך מאפשר רציפה מעקב, הדמיה של transfected In. גישה זו תוויות בדרך כלל 5-20 tangentially העברת תוספות לחתיכה המוח, למזער את מספר האיטראציות ניסיוני נדרש להגיע מובהקות סטטיסטית, תוך תיוג אוכלוסיה עצביים דליל מספיק כדי להבטיח הפרדת קל נוירונים בודדים עבור שחזור והערכה מורפולוגי משובחים. יתר על כן, בהשוואה ל- MGE explants, organotypic תרבויות להבטיח כי העברת תוספות נחשפים סביבה טבעית יותר, כולל נוגדנים מופרשים באופן מקומי, תשומות מ afferents דפנות התלמוס. גישה זו מתאימה מאוד ובכך לכמת את כיוון והנתיב נודדות שאומצה על ידי transfected In, תוך מתן פרטים אנטומיים מספיקים כדי לאפשר אפיון תהליכים דינאמיים עדינה יותר כגון מוביל תהליך הסתעפות, nucleokinesis, נגררים תהליך הכחשה.