Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

皮質 gaba 作動性介在ニューロン (INs) はその生化学的性質、生理学的性質と接続性に関して多様であり、彼らは成熟したネットワーク^{1,2,3 でさまざまな機能を仲介します。、4,5}。皮質の INs のさまざまなサブタイプの仕様が広く調査^1,2されている遺伝子のカスケードを堅く調整されます。大脳皮質 gaba 作動性 INs の大部分 (70%) 内側神経節隆起 (MGE)、腹側に位置する萌芽期の構造の前駆細胞に属し、皮質板^1、に到達する比較的長い距離の間で移行する必要があります。^2,6皮質錐体細胞に移行放射状グリア細胞足場に沿って皮質板 (VZ) の心室の地帯から放射状、さまざまな組み込みが必要ですこのような足場に接続されていない、あるプラグインの接線方向の移動と。非皮質構造^2,7,8から彼らを指導しながら皮質板へ移行するニューロンを誘致する外因性の手がかり。細胞周期を終了すると、アドインは、MGE から皮質板^9,10に向かって接線方向の移動をトリガーする MGE の VZ 内で表現される化学療法反発手掛かりによって撃退されます。アドインの移行異なる反発手掛かり¹¹の援助と線条体を避けるため、皮質板に達すると後、彼らは、接線方向から放射状移動モードに切り替えるし、錐体からキューに応答の一部の彼らの最終的な層流位置に到達セル¹²と他の細胞集団¹³。他の神経細胞の集団として、アドインの移行は、ニューロンの実際の動きを許可する様々 な動的形態変化を伴います。このいわゆる神経運動は 3 つの連続する手順の反復的なサイクルによって特徴付けられる: 主要なプロセス、核 (nucleokinesis) のアクティブな前向性モーション、後続プロセス¹⁴の撤回の伸長。移行ではドライブの分岐と向きと移行^{14,15 の速度を決定する、適切な方向に INs を導く主要なプロセスのアクティブな改造多数の組み込みと外因性手掛かりによって規制されて ,16}。

移行した皮質を規制する要因は、近年^{1,2,7,17,18,19、20}、広く研究されています。つながる神経発達障害、小児難治性てんかんや自閉症スペクトル障害^1,2,21,などいくつかのこれらの分子の俳優の中断が仮定されています。^22,23,24します。 したがって、生体外でそして生体内の様々 なアプローチの開発は以前に再検討された²⁵として、動的な過程を研究する当社の能力が大幅に躍進する追求されてきた。体外メソッド、ボイデン室アッセイとストライプの選択法などを含む神経移行中に要件と特定の遺伝子または蛋白質の細胞の自律的影響を評価するための最速かつ最も再現性のある手段を提供します。他の影響を受けずに^{25 を}を要因します。これらのアッセイは、ライブ イメージング^8,26,27と組み合わせると特に役立ちます。これらの技術を簡単に e13.5 MGE から取得および^{8,28 を以前示すようにその後様々 なシグナル伝達経路と指導の手がかりを調べることができます、酵素と機械的解離によって分離}.ただし、これらの試金は細胞遊走や生存²⁵に影響を与える可能性がある神経細胞の挙動と細胞プロパティを変更するかもしれない三次元組織アーキテクチャの不在で人工細胞外マトリックスの場所を取る。これらの制限を回避するためにex vivo MGE 植は、速度と方向で^{14などのパラメーターと共に移行中に発生する動的形態学的変化を定量化するための代替ツールとして開発されています。 29}。MGE 植を生成するは比較的簡単です、広くされている³⁰を他の場所で説明されています。それは後者がオプション³¹マトリゲルと魅力的または冷淡なキュー²⁵の存在下でコラーゲンの混合物、混合の大脳皮質細胞の膜上に MGE の小さな抽出物のめっきを伴います。MGE 植まばら標識細胞のイメージング、^{32,33 を示したように分岐、主要なプロセス中に骨格改造など、細胞内のプロセスの研究を簡素化する高解像度を可能にします。、34}本研究で。MGE 植は、(例えば、Tielensら2016³³を見なさい) 特定の薬理学的または遊走操作後例えば 2D 環境での移行時に骨格変化を評価するために正常に使用されています。.ただし、この方法で、人工マトリックス内にアドインを移行、これは動作と再現性実験結果の有意性を変更可能性があります。

対照的に、子宮内でエレクトロポレーションのネイティブ環境でプラグインの遺伝子操作を有効にし、迅速かつ効率的の制限を回避しながらゲインの影響と遺伝子機能の損失を評価するために広く使用されている方法です。高価な時間のかかるノックアウトとノックで戦略^25,35。セル型特定プロモーターを使用し、MGE³⁶を含む腹内側核の構造への電極を配置することで、子宮内でエレクトロポレーションを前駆細胞で偏ってすることができます。さらに、子宮内エレクトロポレーションにより実験的構造を 1-2 日内のタイムリーな表現のため構造式を用いたウイルスに必要な 7-10 日に比べてベクトル²⁵。しかし、子宮内でエレクトロポレーションの前駆細胞の低降伏点傾向があります。確かに、背側心室ゾーンにある錐体細胞の前駆細胞を効率的に導入することができますが子宮内を使用して、MGE より腹側に位置する構造をターゲット エレクトロポレーションより技術的に難しいは特に小さな e13.5 に胚と胚性致死性さらに率が高い実験的利回り²⁵が減少します。

体外に関連する技術的な制限のいくつかを回避するために MGE は実験と体内の子宮内でエレクトロポレーションを外植体、脊髄スライス培養前のヴィヴォが開発した^{8,37をされています。 38,39}。脳切片スライス文化提供は安価で生成する動物モデル²⁵よりも時間がかかるしながら体内を模倣の利点が条件します。確かに、これらの準備はプラグインの具体的な可視化と共に、MGE へ簡単にアクセスを許可するより生理的環境⁸に移行するアドインの特定の分子経路を調査する焦点エレクトロポレーションと組み合わせることができます。^,39,40,41我々 はしたがって切片文化³⁸、 ex 子宮穿孔と時間経過の共焦点レーザー顕微鏡と組み合わせて我々 のアプローチを最適化して、さらに形態学的および動的処理の発生評価。中に MGE アドインの接線方向の移動。この議定書は適応し、錐体細胞^42,43の移行を検討するex 子宮または子宮内脳エレクトロポレーションと脊髄スライス培養を使用している人から最適化されたと皮質 INs^36,,3944。具体的には、首をはねられマウス胚と、MGE は electroporated ex vivo実験プラスミドの脳室内注入後より効率的かつ正確に達成できるものよりも MGE 前駆細胞のターゲット子宮内エレクトロポレーション。脳が抽出されると全脳辺縁系を数日間培養することができますに分割、ので、連続追跡 transfected INs のイメージングします。このアプローチは、通常脳スライスあたりの 5-20 接線方向に移行する INs を容易に分離できるように十分にまばらなニューロン集団をラベリングしながら統計的有意性に到達するために必要な実験の繰り返しの数を最小限に抑えることをラベルします。復興と微細形態学的評価のため個々 のニューロン。さらに、切片文化確実に移行する MGE 植に比べて INs はローカル分泌ケモカインと求心系の視床からの入力などを含むより自然な環境に公開されます。この方法は方向性と主要なプロセスの分岐など細かい動的プロセスの評価を許可する十分な解剖学的な詳細を提供している間 transfected INs によって採択された渡り鳥のパスを定量化するに適してnucleokinesis と後続のプロセス撤回。