Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Kortikale Gabaergen Interneuronen (INs) sind vielfältig in Bezug auf ihre biochemische Eigenschaften, physiologische Eigenschaften und Konnektivität, und sie vermitteln verschiedene Funktionen im Reifen Netzwerke^{1,2,3 ,4,5}. Die Spezifikation der verschiedenen Subtypen der kortikalen INs ist streng reguliert durch genetische Kaskaden, die ausgiebig studiert^1,2. Die Mehrheit (70 %) der kortikalen GABAergic INs stammen von Vorfahren in der medialen ganglionic Eminenz (MGE), eine ventral befindet sich embryonale Struktur und muss migrieren über relativ große Entfernungen auf die kortikale Platte^1, zu erreichen ^{2 , 6}. während kortikale Pyramidenzellen Radial auf die kortikale Platte entlang der radialen Glia-Gerüst aus der ventrikulären Zone (VZ) migrieren, die tangentiale Migration ins, die nicht zu solch einem Gerüst befestigt sind, erfordert eine Vielzahl von inneren und extrinsische Signale zu Migration von Neuronen in Richtung der kortikalen Platte zu gewinnen, und führen sie weg von nicht-kortikale Strukturen^2,7,8. Nach Verlassen des Zellzyklus, INs sind abgestoßen von der MGE von Chemo-abstoßende Signale innerhalb der VZ MGE, tangentialer Übergang zu den kortikalen Platte^9,10auslöst. Migration INs vermeiden das Striatum mit Hilfe von verschiedenen abstoßende Signale¹¹ und, nach Erreichen der kortikalen Platte, sie wechseln Sie von einen tangential zu radial Migrationsmodus und erreichen ihre laminar Endlage, teils in Erwiderung auf Signale von Pyramiden Zellen¹² und anderen zellularen Bevölkerungen¹³. Die Migration von INs, wie bei anderen neuronalen Populationen beinhaltet verschiedene dynamische morphologische Veränderungen um die tatsächliche Bewegung des Neurons zu ermöglichen. Diese so genannte neuronale Fortbewegung zeichnet sich durch sich wiederholende Zyklen von drei aufeinander folgenden Schritten: die Dehnung von einem führenden Prozess, eine aktive Anterograde Bewegung des Kerns (Nucleokinesis) und das Einfahren der nachfolgende Prozess¹⁴. BEI der Migration wird durch zahlreiche intrinsische und extrinsische Signale reguliert, die Verzweigungen und aktive Umgestaltung des führenden Prozesses INs führen in die richtige Richtung, Bestimmung, Ausrichtung und Geschwindigkeit der Migration^{14,15 fahren ,16}.

Die Determinanten, die Regulierung der kortikalen Migration haben in den letzten Jahren^{1,2,7,17,18,19,20}ausführlich untersucht, und Störungen in einigen dieser molekularen Akteure hat postuliert, führen zu Entwicklungsstörungen des, wie pädiatrische refraktäre Epilepsie oder Autismus Spektrum Störungen^{1,2,21, 22 , 23 , 24}. daher die Entwicklung von in Vitro und in Vivo Ansätzen verfolgt wurden, um unsere Fähigkeit, dieser dynamischen Prozess, wie zuvor bewertete²⁵erheblich voranbringen. In-vitro- Methoden, einschließlich der Boyden Kammer Assay und der Streifen-Wahl-Test bieten die schnellste und die meisten reproduzierbare Mittel zur Bewertung der Anforderung und Zelle-autonome Auswirkungen von bestimmten Genen oder Proteinen während der neuronalen Migration, ohne der Einfluss anderer Faktoren²⁵. Diese Tests sind besonders nützlich in Kombination mit live-Imaging^8,26,27. Mit diesen Techniken INs leicht aus e13.5 MGE abgerufen und durch enzymatische und mechanische Dissoziation, wonach verschiedene Signalwege und Anleitung Hinweise untersucht werden können, isoliert, wie zuvor dargestellt,^8,28 . Doch statt diese Assays in eine künstliche extrazelluläre Matrix in Ermangelung von dreidimensionalen Gewebearchitektur, die neuronale Verhalten und Zelle Eigenschaften potenziell beeinflussen Zelle Migration und/oder überleben²⁵verändern kann. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden als alternative Instrument zur Quantifizierung der dynamischen morphologische Veränderungen während der Migration zusammen mit Parametern wie Geschwindigkeit und Orientierung^{14 Ex Vivo MGE Explantaten entwickelt, 29}. Generierung von MGE Explantaten ist relativ einfach und wurde ausgiebig³⁰an anderer Stelle beschrieben. Es umfasst die Beschichtung ein kleiner Auszug der MGE auf einem monomolekularen Film gemischte kortikale Zellen oder in einem Gemisch von Matrigel und Kollagen in Anwesenheit von anziehend oder abstoßend Cues²⁵, obwohl letztere optional^{31 sind}. MGE Explantaten ermöglichen hochauflösende Bildgebung des spärlich markierten Zellen, Vereinfachung der Studie von intrazellulären Prozessen, wie Zellskelett Umbau bei führenden Verzweigungen, wie zuvor gezeigt,^{32,33 ,34} und in der vorliegenden Studie. MGE Explantate sind erfolgreich benutzt worden, um dynamische Zellskelett Veränderungen während der Migration in einer 2D Umgebung, zum Beispiel nach bestimmten pharmakologischen oder chemotaktische Manipulationen zu beurteilen (siehe z. B. Tielens Et Al. 2016³³) . Aber mit diesem Ansatz INs Wandern innerhalb einer künstlichen Matrix, und dies könnte IN Verhalten und die Reproduzierbarkeit und die Bedeutung der experimentellen Ergebnisse verändern.

Im Gegensatz dazu in Utero Elektroporation ermöglicht die genetische Manipulation von INs in ihrer natürlichen Umgebung und ist eine weit verbreitete Methode, um schnell und effizient die Auswirkungen von Gewinn und Verlust der Genfunktion beurteilen unter Umgehung der Beschränkungen des Kosten- und zeitintensive Knockout und Knock-in Strategien^25,35. In Utero Elektroporation kann auf IN Stammväter indem Zelle Art spezifische Promotoren und Positionierung der Elektroden in Richtung ventromedialen Strukturen, einschließlich die MGE³⁶voreingenommen sein. Darüber hinaus Elektroporation ermöglicht die rechtzeitige Ausdruck der experimentellen Konstrukte innerhalb von 1-2 Tagen, Vektoren in der Gebärmutter im Vergleich zu den 7-10 Tage benötigt, Konstrukt Ausdruck virale²⁵. Jedoch tendenziell in Utero Elektroporation von IN Stammväter geringer Sprengkraft. In der Tat, obwohl pyramidale Zelle Vorfahren liegt in der dorsalen ventrikuläre Zone effizient transfiziert werden können ist in der Gebärmutter mit Elektroporation, targeting mehr ventral befindet sich Strukturen, z. B. die MGE mehr technisch anspruchsvoll, vor allem in kleinen e13.5 reduziert Embryonen und die hohe Rate der embryonalen Tödlichkeit weiter die experimentelle Ertrag²⁵.

Zur Umgehung der technischen Einschränkungen verbunden mit in-vitro- MGE explant Experimente und in Vivo im Mutterleib Elektroporation, ex Vivo organotypischen Slice Kulturen wurden entwickelten^{8,37, 38,39}. Gehirn organotypischen Slice Kulturen bieten der Vorteil der Nachahmung in Vivo Bedingungen während weniger teuer und zeitaufwendig als Erzeugung von^{25 Tiermodelle}. In der Tat, diese Präparate ermöglichen einen einfachen Zugang zu den MGE, zusammen mit der spezifischen Visualisierung von INs, und ist kombinierbar mit fokalen Elektroporation, spezifische Molekulare Signalwege im INs Migration in einem mehr physiologische Umgebung⁸ zu untersuchen ^{, 39 , 40 , 41}. Wir haben deshalb einen Ansatz für organotypischen Kulturen³⁸, die wir mit Ex Utero Electroporation und Time-Lapse confocal Imaging kombiniert optimiert, zur weiteren Beurteilung die morphologischen und dynamischer Prozess auftretenden bei der tangentialen Migration von MGE-INs. Dieses Protokoll wurde angepasst und optimiert von anderen, die Ex Utero oder in Utero Gehirn Electroporation und organotypischen Slice Kulturen verwendet, um die Migration von Pyramidenzellen^42,43 zu studieren und kortikale INs^36,39,44. Insbesondere mausembryonen enthauptet und die MGE ist elektroporiert Ex Vivo nach der intraventrikulären Injektion von den experimentellen Plasmiden ermöglicht effizientes und präzises targeting von MGE Stammväter als erreichten mit in Utero Elektroporation. Die Köpfe werden dann extrahiert und geschnitten in Gesamt-Hirn koronalen Scheiben, die für ein paar Tage kultiviert werden können, wodurch die kontinuierliche tracking und imaging-transfizierten ins. Dieser Ansatz kennzeichnet in der Regel 5-20 tangential Migration INs pro Gehirn-Scheibe, die Minimierung von experimentellen Iterationen erforderlich, um die statistischen Signifikanz zu erreichen, während die Kennzeichnung einer ausreichend spärlichen neuronalen Bevölkerung dafür einfache Trennung von einzelner Neuronen für Wiederaufbau und feine morphologische Beurteilung. Darüber hinaus im Vergleich zu MGE Explantaten organotypischen Kulturen zu gewährleisten, dass Migration INs ausgesetzt sind ein natürlicher Umgebung, einschließlich lokal sezernierten Chemokine und Inputs thalamische afferenzen. Dieser Ansatz eignet sich daher gut zur Direktionalität und wandernden Weg angenommenen transfizierten INs, bietet ausreichend anatomische Details ermöglicht die Charakterisierung der feineren dynamische Prozesse wie führende Prozess Verzweigung zu quantifizieren, Nucleokinesis und nachgestellten Prozess zurückziehen.