Ex-Utero Электропорация и Organotypic срез культуры мозги эмбриона мыши Live-образов миграции интернейронов ГАМК

Корковых интернейронов ГАМК (INs) разнообразны в отношении их биохимических свойств, физиологические свойства и связи, и они посредником различные функции в зрелых сетей^{1,2,3 ,4,5}. Спецификация различные подтипы корковых INs жестко регулируется через генетических каскадов, которые были широко изучены^1,2. Большинство (70%) корковых ГАМК INs происходят из прародителей в медиальной Ганглиозный возвышение (MGE), вентрально расположен эмбриональной структурой и необходимо перенести на относительно большие расстояния до корковых пластина^{1, 2 , 6}. Хотя кортикального слоя пирамидальных клеток мигрировать радиально от желудочков зоны (VZ) коры пластины вдоль радиальной глии эшафот, тангенциальная миграции модулей, которые не присоединены к такой леску, требует целого ряда внутренних и внешние сигналы для привлечения мигрирующих нейронов к пластину кортикального слоя, при этом направляя их от не корковых структур^2,,78. После выхода клеточного цикла, модули отталкиваются от MGE от химио отвратительный подсказки, выраженных в VZ MGE, который вызывает тангенциальная миграции к корковых плита^9,10. Перенос INs избежать стриатума с помощью различных отталкивающим подсказки¹¹ и, после достижения корковых пластины, они с тангенциальным переключиться в режим радиальная миграция и добраться до их окончательного ламинарные позиции, частично в ответ на сигналы от пирамидальной клетки¹² и других клеточных популяций¹³. Миграция модули, что касается других нейрональных популяций, включает в себя различные динамические морфологических изменений разрешить фактическое движение нейрона. Этот так называемый нейронов локомоции характеризуется повторяющихся циклов трех последовательных этапов: удлинение ведущих процесс, активно антероградная движения ядра (nucleokinesis) и Ретракция конечные процесса¹⁴. В миграции регулируется многочисленные внутренние и внешние сигналы, которые управляют ветвления и активного ремоделирования ведущих процесса для руководства INs в правильном направлении, определение ориентации и скорость миграции^{14,15 ,16}.

В последние годы^{1,2,7,,1718,19,20}, широко изучены факторы, регулирующие корковых в миграции и нарушения в некоторых из этих молекулярных субъектов было постулировано приведет к нервной расстройств, например педиатрических огнеупорных эпилепсии или аутизм спектра расстройства^{1,2,21, 22 , 23 , 24}. Таким образом, чтобы существенно продвинуть вперед нашу способность изучать этот динамичный процесс, как ранее рассмотренных²⁵проводилась разработки различных подходов in vitro и in vivo . В vitro методы, включая Бойден Пробирной палаты и полоса выбор Assay, обеспечивают быстрый и наиболее воспроизводимого средства оценки требования и клеток автономная воздействия конкретных генов и белков во время миграции нейронов, без влияния других факторов²⁵. Эти анализы являются особенно полезными, когда в сочетании с живой изображений^8,,2627. С помощью этих методов модули легко извлекаются из e13.5 МГЕ и изолированные ферментативные и механических диссоциации, после чего можно исследовать различные сигнальные пути и указания подсказки, как показано ранее^8,28 . Однако эти анализы проходят в искусственных внеклеточного матрикса в отсутствие трехмерные ткани архитектуры, которые могут изменить нейрональных поведение и ячейки свойства, потенциально влияющие ячейки миграции и/или выживание²⁵. Чтобы обойти эти ограничения, ex vivo МГЕ эксплантов были разработаны как альтернативную инструмент для количественной оценки динамических морфологические изменения, происходящие во время миграции, а также такие параметры, как скорость и ориентации в^{14, 29}. Создание МГЕ эксплантов является относительно простым и была широко описано в других разделах³⁰. Это предполагает покрытие небольшой экстракт МГЕ на монослое смешанных корковых клеток или в смеси matrigel и коллагена в присутствии привлекательным или отталкивающего подсказки²⁵, хотя последние являются Факультативным³¹. МГЕ эксплантов позволяют высоким разрешением изображений малонаселенных помеченных клеток, упрощение исследования внутриклеточных процессов, таких как цитоскелета реконструкции в процессе ведущих ветвления, как показано ранее^{32,33 ,34} и в настоящем исследовании. МГЕ эксплантов успешно использовались для оценки динамических цитоскелета изменения во время миграции в 2D среде, например после конкретных фармакологических или эозинофилов манипуляций (см., например, Тиленс et al. 2016³³) . Однако с этим подходом, INs мигрируют в пределах искусственного матрицы, и это может привести к изменению в поведении и воспроизводимость и значимость экспериментальные результаты.

Напротив в утробе матери электропорации позволяет генетические манипуляции INs в их родной среде и широко используемый метод, чтобы быстро и эффективно оценить влияние выгоды и потери функции гена в обход ограничений дорогостоящей и трудоемкой Выбивное и стук в стратегии^25,35. В утробе матери электропорации может быть смещенной в отношении в прародителей, используя ячейки типа конкретных промоутеров и позиционирование электрода к вентромедиального структур, в том числе МГЕ³⁶. Кроме того в утробе матери электропорации позволяет своевременно выражение экспериментальных конструкций в течение 1-2 дней, по сравнению с 7-10 дней, необходимых для конструкции выражения с использованием вирусных векторов²⁵. Однако в утробе матери электропорации из в прародителями клонит быть малой мощности. Действительно, хотя пирамидальной клетке прародителями, расположенных в зоне спинной желудочков может эффективно transfected в утробе матери электропорация, ориентации более вентрально расположен структур, таких как MGE, более технически сложных, особенно в небольших e13.5 эмбрионы и высокий уровень эмбриональных летальность далее уменьшает экспериментальная урожайность²⁵.

Чтобы обойти некоторые технические ограничения, связанные с in vitro МГЕ explant экспериментов и в естественных условиях в утробе электропорация, ex vivo organotypic срез культур были развитыми^{8,37, 38,39}. Мозг organotypic срез культур предложение условия преимущество передразнивать в естественных условиях , будучи менее дорогостоящим и длительным, чем формирование животных моделей²⁵. Действительно эти препараты позволяют легко доступ к MGE, наряду с конкретными визуализации INs и могут быть объединены с фокуса электропорации расследовать конкретные молекулярные пути в Син, перенос в более физиологических окружающей среды^{8 , 39 , 40 , 41}. Поэтому мы оптимизировали подход для organotypic культур³⁸, который мы в сочетании с экс-utero электропорации и time-lapse конфокальная томография, для дальнейшей оценки происходящих морфологических и динамичный процесс во время тангенциального миграции МГЕ-модулей. Настоящий Протокол была адаптирована и оптимизирована от других, которые использовали для изучения миграции пирамидальных клеток^42,43 бывших внутриутробно или в утробе матери мозга электропорации и organotypic срез культур и корковых INs^36,,3944. В частности обезглавлен эмбрионов мыши и MGE является electroporated ex vivo после внутрижелудочкового введения экспериментальной плазмиды, позволяя более эффективной и точной ориентации МГЕ прародителей чем то, что может быть достигнуто с в утробе матери электропорации. Затем извлекаются мозги и секционного корональных ломтиками весь мозг, которые могут быть культивировали на несколько дней, таким образом позволяя непрерывное отслеживание и изображений из transfected INs. Этот подход обычно этикетки вскользь миграция модули 5-20 на срез мозга, свести к минимуму количество экспериментальных итераций, необходимых для достижения статистической значимости, при маркировке достаточно редкий нейронов населения для обеспечения легко разделение отдельных нейронов для реконструкции и тонкой морфологической оценки. Кроме того по сравнению с МГЕ эксплантов, organotypic культур убедитесь, что миграция модули подвергаются более естественной окружающей среды, включая локально выделяется chemokines и входы от таламуса афферентов. Таким образом, этот подход является хорошо подходит для количественного определения направленности и пути миграции, принятых transfected INs, предлагая достаточно анатомические детали, чтобы позволить характеристика тонкой динамических процессов, таких как ведущий процесс ветвления, nucleokinesis и завершающие процесс отзыва.