Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

Corticales interneurones GABAergiques (INs) sont diverses en ce qui concerne leurs propriétés biochimiques, connectivité et les propriétés physiologiques et ils véhiculent des fonctions différentes dans des réseaux matures^{1,2,3 ,4,5}. La spécification de différents sous-types des INs corticale est étroitement contrôlée par le biais de cascades génétiques qui ont été étudiés^1,2. La majorité (70 %) des corticales GABAergic INs proviennent de géniteurs dans l’éminence ganglionnaire médial (MGE), une structure embryonnaire située sur le ventre et doit migrer sur des distances relativement longues pour atteindre la plaque corticale^{1, 2 , 6}. tandis que les cellules pyramidales corticales migrent radialement de la zone ventriculaire (VZ) à la plaque corticale le long de l’échafaudage de la glie radiale, la migration tangentielle de l’INs, qui ne sont pas attachés à un tel échafaudage, exige une variété d’intrinsèque et signaux extrinsèques pour attirer la migration des neurones vers la plaque corticale, tout en guidant des structures corticales non^2,7,8. Après la sortie du cycle cellulaire, INs sont repoussés de la MGE par chimio-répulsive repères exprimées au sein de la VZ de la MGE, qui déclenche la migration tangentielle vers la plaque corticale^9,10. La migration INs éviter le striatum avec l’aide de différents indices répulsive¹¹ et, après avoir atteint la plaque corticale, ils passer d’une tangente à un mode de migration radial et atteint leur position finale laminaire, en partie en réponse aux signaux du pyramidal les cellules¹² et autres populations cellulaires¹³. La migration de l’INs, en ce qui concerne les autres populations neuronales, implique divers changements morphologiques dynamiques afin de permettre le mouvement réel du neurone. Ce que l’on appelle locomotion neuronale est caractérisée par des cycles répétitifs de trois étapes successives : l’allongement d’un processus de premier plan, un mouvement actif antérograde du noyau (nucleokinesis) et la rétraction de la fin du processus¹⁴. EN migration est réglementée par les nombreux signaux intrinsèques et extrinsèques qui alimentent la ramification et remodelage actif du processus de premier plan pour guider l’INs dans le bon sens, déterminer l’orientation et vitesse de migration^{14,15 ,},¹⁶.

Les déterminants de la régulation corticale en migration ont été largement étudiées ces dernières années^{1,2,7,17,18,19,20}, et perturbation dans certains de ces acteurs moléculaires a été postulée à conduire à des troubles du développement neurologique, comme pédiatrique réfractaires épilepsie ou l’autisme du spectre des troubles^{1,2,21, 22 , 23 , 24}. par conséquent, le développement de diverses approches in vitro et in vivo a été poursuivi pour faire avancer notre capacité à étudier ce processus dynamique, comme précédemment examiné²⁵. Méthodes in vitro , y compris le test de chambre de Boyden et le test de choix Stripe, fournissent le moyen le plus rapide et plus reproductible d’évaluer le besoin et l’impact cellules autonomes de certains gènes ou de protéines au cours de la migration neuronale, sans l’influence d’autres facteurs²⁵. Ces analyses sont particulièrement utiles lorsqu’il est combiné avec l’imagerie live^8,26,27. Avec ces techniques, INs sont facilement Récupérée de e13.5 MGE et isolé par une dissociation enzymatique et mécanique, après quoi les différentes voies de signalisation et signaux de guidage peuvent être étudiées, tel qu’illustré précédemment^8,28 . Cependant, ces essais ont lieu dans une matrice extracellulaire artificielle en l’absence d’architecture tissulaire en trois dimensions, qui peut modifier les propriétés neuronales de comportement et de la cellule, susceptibles d’influer sur cell migration et/ou survie²⁵. Pour contourner ces limitations, les explants MGE ex vivo ont été développés comme outil de rechange pour quantifier les modifications morphologiques dynamiques survenant au cours de la migration ainsi que des paramètres tels que la vitesse et l’orientation^{14, 29}. Génération d’explants de MGE est relativement simple et a été abondamment décrit ailleurs³⁰. Elle implique le bordé d’un petit extrait de la MGE sur une monocouche de cellules corticales mixtes ou dans un mélange de matrigel et collagène en présence de signaux attractives ou répulsives²⁵, même si ces derniers sont optionnels³¹. Des explants MGE permettant de haute résolution d’imagerie de cellules peu marquées, de simplifier l’étude des processus intracellulaires, comme le remodelage du cytosquelette durant les principaux processus de ramification, comme indiqué précédemment^{32,33 ,34} et dans la présente étude. MGE explants ont été utilisés avec succès pour évaluer les changements cytosquelettiques dynamiques lors de migration dans un environnement 2D, par exemple après des manipulations pharmacologiques ou chimiotactiques spécifiques (voir, par exemple, Tielens al 2016³³) . Cependant, avec cette approche, INs migrent au sein d’une matrice artificielle, et cela pourrait changer dans le comportement et la reproductibilité et la signification des résultats expérimentaux.

En revanche, dans l’utérus électroporation permet la manipulation génétique des INs dans leur milieu d’origine et est une méthode largement utilisée d’évaluer rapidement et efficacement l’impact du gain et la perte de la fonction du gène tout en contournant les limitations de knockout coûteuse et chronophage et knock-in stratégies^25,35. In utero électroporation peut être biaisée vers en cellules souches à l’aide de promoteurs spécifiques de type cellulaire et en positionnant les électrodes vers des structures ventromédian, y compris le MGE³⁶. En outre, dans l’utérus électroporation permet l’expression opportune de constructions expérimentales dans les 1-2 jours, comparativement aux 7-10 jours requis pour construire l’expression utilisant virale vecteurs²⁵. Toutefois, dans l’utérus électroporation d’en progéniteurs tend à être de faible rendement. En effet, bien que les progéniteurs de cellule pyramidale situées dans la zone ventriculaire dorsale peuvent être efficacement transfectées utilisant in utero électroporation, ciblage des structures plus ventralement situés, comme le MGE, est techniquement plus difficile, surtout dans les petites e13.5 embryons et le taux de létalité embryonnaire plus élevé réduit le rendement expérimental²⁵.

Pour contourner certaines limitations techniques associées en vitro MGE explantation des expériences et en vivo in utero électroporation, ex vivo organotypiques ont été développés^{8,37, 38,39}. Cerveau organotypique tranche cultures offre l’avantage d’imiter en vivo les conditions, tout en étant moins long et coûteux que les modèles de production animaux²⁵. En effet, ces préparations permettent un accès facile à la MGE, ainsi que la visualisation spécifique de l’INs et peuvent être combinées avec focale électroporation pour étudier les voies moléculaires spécifiques dans INs migration dans un plus physiologique environnement^{8 , 39 , 40 , 41}. nous avons donc optimisé une approche pour organotypique cultures³⁸, dont nous avons combiné avec l’ex utero électroporation et Time-lapse imagerie confocale, afin d’évaluer les processus morphologiques et dynamiques survenant au cours de la migration tangentielle de MGE-INs. Le présent protocole a été adapté et optimisé d’autres personnes qui ont utilisé des ex utero ou in utero cerveau électroporation organotypique tranche cultures et d’étudier la migration des cellules pyramidales^42,43 et corticale INs^36,39,44. Plus précisément, des embryons de souris sont décapités et la MGE est électroporation ex vivo après l’injection intraventriculaire des plasmides expérimentales, permettant aux plus précis et efficace ciblant des progéniteurs MGE que ce qui peut être réalisé avec dans l’utérus électroporation. Les cerveaux sont ensuite extraites et sectionnées en tranches coronale de cerveau entier qui peuvent être mis en culture pendant quelques jours, permettant ainsi continu de suivi et d’imagerie ins transfectées. Cette approche étiquettes généralement 5 à 20 tangentiellement migration INs par tranche de cerveau, réduisant au minimum le nombre d’itérations expérimentales nécessaires pour atteindre la signification statistique, tandis que l’étiquetage d’une population neuronale suffisamment rares pour assurer une séparation facile des neurones individuels pour la reconstruction et l’évaluation morphologique fine. En outre, par rapport à des explants MGE, culture organotypique assurer cette migration INs sont exposés à un environnement plus naturel, y compris les chimiokines sécrétée localement et contributions des afférences thalamiques. Cette approche est donc bien adaptée pour quantifier la directivité et la voie de migration adopté par INs transfectées, tout en offrant des détails anatomiques suffisantes pour permettre la caractérisation des processus dynamiques plus fines comme les principaux processus de branchement, nucleokinesis et rétraction fin de processus.