Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

Hinweis: Eine Übersicht über die Methode ist in Abbildung 1gezeigt. 1. Planung der Klon-Strategie Wählen Sie zwei vermeintlich interagierenden Proteine getestet werden.Hinweis: Jeder der beiden Proteine werden zu einem Split-BioID Fragment abgesichert werden: entweder NBirA * oder CBirA *. Als Negativkontrolle, CBirA * Fusionsproteine mit NBirA * verschmolzen, das grün fluoreszierende Protein getestet werden (NBirA *-GLP). Als zusätzliche Kontrolle können die NBirA * Fusionen allein, ohne cognate CBirA * Fusion oder in Kombination mit einem CBirA * verschmolzen zu einem unabhängigen Protein getestet werden. Es ist ratsam, nicht CBirA * benutzen-GFP als Negativkontrolle als es konnte gezeigt werden, konsequent zu wichtigen Hintergrund kombiniert alle NBirA * Fusion Protein9führen. Die Ursache für diese Beobachtung möglicherweise die Expression von CBirA *-GFP, viel höher als jede andere CBirA * Fusionsproteine wir bisher verwendet haben, die zu erheblichen Neuzuordnung mit dem NBirA * Fragment führen können. Sobald zwei Proteine ausgewählt sind, Überprüfen der Literatur zu finden, ob beide bereits erfolgreich in funktionelle Studien (z. B. als ein GLP-Tags Fusionsprotein) markiert haben. Wenn solche Studien vorhanden sind, beachten Sie die Position des Tags (bei N – oder C-Terminus) und verwenden Sie die gleiche Ausrichtung um die Proteine des Interesses mit der Split-BioID Fragmente zu markieren. Existiert keine solche Studie Plan Konstrukte für beide Proteine kodierenden markiert an der N – und C-Terminus und planen eine Probe zum Testen der Funktionalität von Fusionsproteinen (z. B. ein Rettungs-Experiment in eine Zelllinie erschöpft für das WT-Protein).Hinweis: Wenn zwei Fusionsproteine mit den Plasmiden in Abbildung 2 beschrieben, die langen, flexiblen Linker verschlüsseln Paarung, spielt die Ausrichtung von Fusionsproteinen (BirA * Fragmente verschmolzen flussaufwärts oder flussabwärts interessierender Proteine) in der Regel keine Rolle . In der Tat mit FRB und FKBP als Modell Proteine, es zeigte sich, dass alle vier möglichen Iterationen (beide Fragmente in der N-Termini, sowohl auf die C-Termini, an der N-Terminus und die andere dem C-Terminus, und vice versa) ergeben vergleichbare biotinylierungen9. Design-Primer, ORFs der beiden Proteine des Interesses für das Klonen in der Split-BioID Plasmide zu verstärken. Achten Sie darauf, dass die Übersetzung Rahmen die BirA * Fragmente identisch sind. Verwenden Sie die Plasmide in Abbildung 2beschrieben, die Restriktionsenzyme PmeI und PacI, um der CBirA * Fusion und die Enzyme ClaI und MluI für die NBirA * Fusion zu konstruieren.Hinweis: Die Plasmide in Abbildung 2 dargestellten tragen eine Bi-direktionale Tet-responsive Element flankiert von F3/FRT Rekombination Websites. Dies ermöglicht den regulierten Co Ausdruck in etwa auf dem Niveau der beiden Schmelzverfahren Proteine aus der gleichen Plasmid-10und die Möglichkeit, schnell zu stabilen Zelllinien durch Rekombination-vermittelten Kassette Austausch (RMCE) konstruieren. In diese Plasmide hat NBirA * einen Myc-Tag CBirA * einen FLAG-Tag. ORFs können selbstverständlich auch auf individuelle Plasmide mit konstitutiven Promotern geklont werden.Entscheidender Schritt: Wenn Sie zwei interagierenden Proteine zu testen, es wird empfohlen, NBirA * verschmolzen zu Protein 1 kombiniert mit CBirA * verschmolzen zu Protein 2 vergleichen, und NBirA * verschmolzen Protein 2 kombiniert mit CBirA * mit Protein 1 verschmolzen. In der Tat ist es häufig zu beobachten, dass eine Iteration besser als die andere funktioniert. 2. Klonen ORFs der Gene von Interesse in der Split-BioID Plasmid Hinweis: In diesem Beispiel gelten zwei Proteinen, die am N-Terminus gekennzeichnet werden kann. Vier Voraussetzungen werden geprüft und im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen (Tabelle 1). Verwenden Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verstärken die ORFs der beiden Proteine mit den entsprechenden Primer getestet werden. Design-Primer, die ClaI und MluI Restriktionsschnittstellen für die NBirA * Fusionsproteine und die Standorte für die CBirA * Fusionsproteine PacI und PmeI einzuführen.Hinweis: Die PCR kann mit keinem kommerziellen erfolgen bevorzugt Korrekturlesen, DNA-Polymerase. Folgen Sie das Standardprotokoll aus dem Handbuch und Anpassung an die Schmelztemperatur der Primer und die Länge des ORF nach den Herstellerrichtlinien verstärkt werden. Die ersten ORF subclone Plasmid (etwa 2 μg) und PCR verstärkt ORF1 (bis zu NBirA * fusioniert werden) mit ClaI und MluI zu verdauen. Führen Sie Verdauung Reaktionen mit 1 μl jedes Enzym, gemischt mit das entsprechende Volumen der DNA und Reaktion-Puffer in einem Gesamtvolumen von 20 μl in eine 1,5 mL Tube für 1 h bei 37 ° C. Führen Sie beide Verdauung Proben auf einem 1 % Agarose-TAE DNA-Gel. Verbrauchssteuern Sie die Bänder entsprechend verdaute Plasmid und ORF1 mit einem sauberen Skalpell und Übertragung auf 1,5 mL Röhrchen. Beide Bands mit einem standard DNA Extraktion Kit zu reinigen. Verbinden verdaute Plasmid und ORF1 mit standard Reagenzien. Wenn mit der Ligatur Kit entnehmen Sie bitte Tabelle von Materialien, verbinden 100 ng DNA enthalten drei bis fünf Mal molaren Überschuss einfügen über Plasmid in einem Gesamtvolumen von 4,5 μl. 5 μL der 2 x T4 Ligase Puffer und 0,5 μl T4 DNA-Ligase aus dem Ligatur-Kit hinzufügen. Führen Sie die Ligatur Reaktion in einem 1,5 mL-Röhrchen für 10 min bei Raumtemperatur (RT). DH-5α E. Coli zuständigen Standardzellen (zubereitet nach Inoue Methode11) verwandeln. Mix 3 μL der Ligatur Reaktion mit 50 μl kompetente Zellen in einem 1,5 mL tube auf Eis und inkubieren Sie für 30 min. Transfer der Zellen eine Hitze blockieren auf 42 ° C für 30-45 s und inkubieren Sie dann wieder auf Eis für 2 min. Fügen Sie 250 μl vorgewärmten (37 ° c) Lysogeny Brühe (LB) Medium und Platte 100 μL der Zellen auf einer vorgewärmten (37 ° C) Ampicillin-haltigen LB-Agar-Platte. Die Zellen über Nacht bei 37 ° c inkubieren Am nächsten Tag wählen Sie vier bis sechs Kolonien und inkubieren sie bei 37 ° C, 180 u/min, Übernachtung in 3 mL LB-Medium mit 100 μg⋅mL-1 Ampicillin in einer 15 mL Tube. Isolieren Sie die Plasmiden aus den entnommenen Kolonien mit einem standard-DNA MiniPrep Kit. Überprüfen Sie die Richtigkeit der Plasmide von Sanger-Sequenzierung mit der Kassette 2 rückwärts-Primer (Tabelle 2). Nachdem ein Plasmid mit dem ersten ORF identifiziert wurde, subclone zweite ORF in diesem Plasmid folgen die gleichen Schritte wie Schritt 2.2 aber mit PmeI und PacI Enzyme. Reihenfolge der daraus resultierenden Plasmide mit Kassette 1 rückwärts-Primer (Tabelle 2). 3. Prüfung der Fusionsproteine Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für dual induzierbaren Ausdruck Plasmide (Abbildung 2) und HeLa-11ht Zellen, eine subclonal HeLa-CCL2-Zelllinie, stabil mit dem Ausdruck der reversen Transkription Tetracyclin-gesteuerte Aktivator RtTA-M2 und mit einer Lokus für RMCE12. Das Wachstumsmedium für diese Zellen ist Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % Tetracyclin-freie fetalen bovine Serum (FBS). Wenn Sie eine andere Zelle Art zu verwenden, müssen genaue Aussaat Bedingungen und Wachstumsmedium angepasst werden. Transiente Transfektion Samenzellen in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen in 2 mL pro Bohrloch eine sechs-Well-Platte am Vortag Transfektion und die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator inkubieren. Am Tag der Transfektion Medium jedes gut entfernen und ersetzen mit 2 mL frisches Medium. Bereiten Sie die vier Transfektion Reaktionen gemäß Tabelle 1. Fügen Sie für jedes gut zu transfizieren 6 µg Polyethylenimine 3 µg Plasmid DNA in einem 1,5 mL steriles Röhrchen und Füllung 500 µL mit DMEM Medium ohne Serum hinzu. Inkubieren Sie jede Transfektion Mischung für mindestens 5 min bei Raumtemperatur, vor dem Hinzufügen von Drop weisen in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2. Induktion und Nähe-Kennzeichnung Am Tag nach der Transfektion, das Medium zu entfernen und ersetzen durch Medium mit Biotin bei 50 µM, biotinylierungen zu stimulieren und Doxycyclin bei 200 Ng⋅mL−1 induzieren die Expression der Fusionsproteine ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 20 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2. Um eine Stammlösung von Biotin zu machen, auflösen Biotin bei 50 Mg⋅mL-1 (entspricht ca. 200 mM) in 2 M Ammonium Hydroxid. Sobald es vollständig aufgelöst ist, verdünnen Sie es bis 50 mM in 500 mM Hepes, pH 7,4, dann einstellen des pH-Werts 7,4 mit HCl. Aliquot und die daraus resultierende 1.000 x Stammlösung bei-20 ° C. Doxycyclin bei 10 Mg⋅mL-1 in 70 % igem Ethanol und Shop in einem Schraubdeckel reaktionscup bei-20 ° C im Dunkeln zu lösen. Zelle lysate Vorbereitung Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL kalt (4 ° C) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie in jede Vertiefung 100 µL der Lyse Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM DTT und Protease-Inhibitoren hinzu). Ernten Sie die Zellen mit einer Zelle Schrotter und Übertragung auf 1,5 mL Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 X g für 10 min bei 4 ° C, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie die Überstände an frischen Rohre und auf Eis. Protein-Mengen mit einem Bradford-Test zu bestimmen. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western blotting Bereiten Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gel. Für jede geräumt lysate, bereiten eine Seite Probe 30 µg (mindestens 15 µg) Protein in insgesamt 30 µL SDS-laden-Puffer. Dann laden Sie gleiche Mengen von jeder Probe (20 µL/Well) auf die SDS-Polyacrylamid-Gel und fahren Sie mit Elektrophorese. Übertragen Sie nach der Elektrophorese die fraktionierte Proteine auf eine geringe Fluoreszenz PVDF-Blot Membran Standardprotokolls.Hinweis: Für die Analyse von Protein-biotinylierungen, eine 10 min Transferzeit mit dem “hohen MW” Programm von einem schnellen transfer halbtrocken, die Western Blot-Gerät in der Regel gut funktioniert. Blockieren Sie nach der Übertragung die Membran in 5 % Trockenmilch mit PBS-Puffer für 30 min bei RT Inkubieren Sie die Membran für 30 – 60 min bei RT mit fluoreszierenden Streptavidin conjugate verdünnt 1: 15.000 mit PBS-Puffer mit 2 % BSA und 0,1 % Tween-20. Waschen Sie die Membran dreimal, jeweils für 10 min. mit PBS mit 0,1 % Tween-20 und dann einmal mehr mit PBS. Scannen Sie die Membran auf einem Fluoreszenz-Scanner-imaging-System.Hinweis: eine typische Western-Blot ist in Abbildung 3gezeigt. Das oben beschriebene Verfahren beschreibt eine Leuchtstoff-basierte Erkennung aber eine Lumineszenz-basierte Erkennung mit HRP-gekoppelte Streptavidin funktioniert genauso gut. (4) Split-BioID für Proteomics Studien Kritische Anmerkung: Für die endgültige massenspektrometrische Analyse, alles, was die folgenden Schritte sind in Keratin-freien Bedingungen durchgeführt werden sollte alle Materialien und Reagenzien wie Keratin-frei wie möglich sein. Transiente Transfektion Am Vortag Transfection Samen drei bis vier 10 cm Platten für jede Bedingung in einer Konzentration von 8 x 105 Zellen in 10 mL pro Platte, und die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator inkubieren. Am nächsten Tag bereiten Sie einen master Transfektion Mix für jede Transfektion Bedingung: für drei Platten pro Zustand, 36 µg Polyethylenimine und 18 µg Plasmid DNA aufgelöst in 900 µL serumfreien DMEM. Inkubieren Sie jeder master-Mix für mindestens 5 min bei RT In der Zwischenzeit ersetzen Sie das Medium der einzelnen Gerichte mit frischen Medium, und fügen Sie 300 µL der Transfektion Mischungen Tropfen Weise auf jede Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2. Induktion und Nähe-Kennzeichnung Übertragen Sie am Tag nach der Transfektion, die Zellen auf 15 cm Gerichte. Für jedes Gericht das Medium zu entfernen, Waschen der Zellen mit 7 mL PBS, 1,5 mL Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und inkubieren Sie für 5 min bei RT. Fügen Sie 3,5 mL Wachstumsmedium Aufschwemmen der Zellen und die Zellsuspension auf eine 15 cm Schüssel gefüllt mit 20 mL Wachstumsmedium übertragen mit Biotin bei 50 µM, biotinylierungen zu stimulieren und Doxycyclin bei 200 Ng⋅mL−1 (Endkonzentrationen) induzieren die Expression der Fusionsproteine ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 20 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2. Ernte und Lagerung der Zellen Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, dann jede Platte 1,5 mL PBS hinzu und ernten Sie die Zellen mit ein Nahkämpfer. Die geernteten Zellen entspricht einer Bedingung zu einer 15 mL Tube übertragen und Ernte sie durch Zentrifugation bei 1.200 X g, 5 min, 4 ° C. Entfernen Sie die Überstände und Snap Pellets Einfrieren in flüssigem Stickstoff, dann bei 80 ° C bis zu Weiterverarbeitung.Hinweis: Alternativ Zellen können auch losgelöst von Trypsinization, geerntet im Wachstumsmedium, übertragen eine 15 mL-Tube und vor dem Einfrieren dreimal mit PBS gewaschen. Vorbereitung der Zelle lysates Aufschwemmen der Zelle Pellets in 1 mL Lyse-Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4 % SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DVB-t, 1 x komplette Protease-Hemmer) bei RT Pass die Zellen 10-20 mal (fünf bis zehn Schläge) durch eine 25 G Nadel. Beschallen Sie die Proben mit einem Sonifikation Gerät.Hinweis: Mit dem Sonifikation Gerät gemäß Tabelle der Materialien, das folgende Programm kann verwendet werden: vier Zyklen mit hoher Intensität, 30 s pro Zyklus in einem kalten (4 ° C) Wasserbad. Ein anderes Sonifikation-Gerät eignet sich aber Parameter müssen entsprechend angepasst werden. Fügen Sie Triton x-100, die wiederhergestellten sonorisiert lysate, eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen (in der Regel fügen 100 μL 20 % Triton x-100 bis 900 μl sonorisiert Zelle lysate), und dann 2,3 mL 50 mM Tris, pH = 7,4 pro 1 mL lysate, die NaCl-Konzentration bis zu 150 mM vor b einzustellen Inding zu Streptavidin-gekoppelten Perlen.Kritische Anmerkung: Höheren Salzkonzentrationen führen oft zu viel weniger effizient Bindung an die Perlen. Die bereinigte Lysates in 1,5 mL Tuben zu verteilen (ca. 1,1 mL in drei Tuben) und Zentrifugieren sie auf 16.000 x g, 10 min, 4 ° C. Die Überstände zu übertragen (ca. 3,2 mL) 15 mL-Tube zu halten 50 – 100 μL als INPUT-Material. Messen Sie die Konzentration von jeder Probe mit einem Bradford-Test und Gegenwert von 3 bis 3,5 mg Protein-Inhalt für die Streptavidin-Pulldown. Streptavidin-pulldownHinweis: Eine Übersicht über das Pulldown-Verfahren ist in Abbildung 4gezeigt. Es ist fast identisch mit dem ursprünglichen Protokoll von Roux und Kollegen2veröffentlicht. Zum ersten Mal der Pulldown erfolgt, Proben Durchströmung und Wash 1 – 4 können beiseite für Western-Blot Analyse um sicherzustellen das Verfahren funktionierte einwandfrei (Abbildung 5). Übertragen Sie für jede Bedingung 200 μL der Streptavidin-gekoppelten magnetischen Beads Aussetzung zu einer 1,5 mL-Tube. Legen Sie die Rohre auf einem magnetischen Gestell, warten, bis die Perlen an der Seite der Rohre kleben (ca. 1 min) und entfernen Sie den Puffer speichern. Waschen Sie die Perlen durch sanft mischen mit 1 mL Gleichgewichtherstellung Puffer (50 mM Tris pH 7 – 4, 150 mM NaCl, 0,05 % Triton x-100 und 1 mM DVB-t). Versenden Sie die äquilibriert Perlen in gleicher Betrag in die notwendige Anzahl von Rohren (in der Regel zu Beginn mit 3 – 3,5 mg Protein Inhalt, Lysaten aus jede Bedingung in zwei bis vier 1,5 mL Röhrchen versendet werden können) und Platz zurück auf die magnetische Gitter. Entfernen des Gleichgewichtherstellung Puffers und jeden Satz von Perlen mit gleichen Mengen der entsprechenden Zelle Lysates aus Schritt 4.4.7 Aufschwemmen. Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Am nächsten Tag legen Sie die 1,5 mL Röhrchen auf einem magnetischen Gestell, warten Sie, bis die Perlen halten Sie sich an der Seite der Rohre und die Überstände auf eine 15 mL-Tube mit der Bezeichnung als fließen durch übertragen.Hinweis: ab sofort sind alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Aufschwemmen der Perlen in jedem Röhrchen mit 200 μl Waschpuffer 1 (2 % SDS im Wasser), und jeder Satz resuspendierte Perlen eine Bedingung in 1,5 mL Röhrchen entsprechend kombinieren. Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 1. Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 2 (50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1 % Triton X-100 und 0,1 % Na-Deoxycholate). Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LICI, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40 und 0,5 % Na-Deoxycholate). Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 4 (50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, 0,1 % NP-40). Um sicherzustellen, dass die Waschpuffer vollständig entfernt wird, nachdem die letzte Schritt zu waschen, entfernen die meisten des Überstands und dann spin-down der Proben. Legte sie zurück auf die magnetische Rack, warten Sie, bis die Perlen halten Sie sich an der Seite der Röhren und entfernen Sie dann die verbleibenden Puffer. Fügen Sie 30 μl der Elution Puffer (10 mM Tris pH 7.4, SDS 2 %, 5 % β-Mercaptoethanol und 2 mM Biotin) zu den Perlen. Bei 98 ° C für 15 min inkubieren Sie, dann entfernen Sie sofort die Perlen auf einem magnetischen Gestell. Übertragen Sie die eluierten Probe auf eine frische Rohr und speichern bei-20 ° C bis zu Weiterverarbeitung. SDS-PAGE und Western blottingHinweis: Vor der Massenspektrometrie Analyse empfiehlt es zu beurteilen, den Erfolg der biotinylierungen und Pulldown von SDS-PAGE und Western-Blot. Wenn keine biotinylierungen Muster zu beobachten ist, dass man bedenkt, dass kann entweder Dox oder Biotin wurde nicht hinzugefügt, um das Medium oder, dass eines der beiden Stammlösungen gefährdet ist. Bereiten Sie für jede eingabesample eine Seite Probe durch gleiche Mengen von Protein-Probe mit dem entsprechenden Volumen von 3 X SDS-Loading Buffer in insgesamt 28 μL mischen vor. Bereiten Sie Seite Proben durch das Mischen von 5 µL jeder Elution Probe mit 2,5 µL 3 X SDS-Loading Puffer vor. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel (25 µL/Well für Eingänge, 7 µL/Well für Elution Proben). Fahren Sie mit Elektrophorese und Western Blot-wie in Kapitel 3.4 beschrieben. Wenn den Pulldown zum ersten Mal durchführen, Seite Proben vorbereiten für jeden Schritt des Pulldown (Input, Durchströmung, Wash 1 – 4, Elution) durch das Mischen von 20 µL jeder Probe (Input, Durchströmung, Wash 1 – 4) mit 10 µL 3 x SDS-Loading Puffer oder 5 µL (Elution) mit 2,5 µL 3 x S DS-Loading buffer und gehen Schritt 4.6.4 (Abbildung 5). SDS-PAGE für MS-AnalyseHinweis: Zur Minimierung von möglichen Keratin Kontamination können vorgefertigte Gele und kommerziellen Probenpuffer Laden verwendet werden. 18,75 μL jeder Elution Probe 6,25 μL des 4 X Probenpuffer hinzu und laufen Sie die Proben auf einem 4 – 20 % Fertigteile SDS-Gel, bis sie 2 – 3 cm in das Gel Wandern. Färben Sie das Gel mit kolloidalem Coomassie brillant Blue G250 Färbung13 in einer Petrischale 15 cm. Verwenden Sie eine saubere Skalpell Verbrauchsteuern die ganze Gassen für jede Probe, ausgenommen die Streptavidin-Band (mit ca. 17 kDa, Abbildung 6), und die ausgeschnittenen Bands auf 1,5 mL Röhrchen übertragen. Senden Sie diese Proben zu einer Proteomics-Anlage zur weiteren Analyse.Hinweis: Typisch MS Ergebnisse sehen Sie in der Referenz 9 (Abbildung 3 und Abbildung 7und zusätzliche Tabellen). Die ganze Datensätze stehen auf der PRIDE-Repository (Zbl-Nummer PXD005005).